樂貽軍 王 紅 鐘雄平 劉 超 陳業(yè)金

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院消化科(510180)

范可尼貧血(FA)是一種常染色體或X染色體連鎖的隱性遺傳性疾病，在各人種中均有發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A患者的主要特征是骨髓造血功能障礙、先天性畸形以及對腫瘤易感性升高[1-2]。迄今已發(fā)現(xiàn)與FA疾病相關(guān)基因15個，一旦這些基因出現(xiàn)突變就會出現(xiàn)FA或類似FA的綜合征[2]。由這些基因編碼的蛋白共同組成了所謂的FA通路，目前大量研究顯示該通路主要對DNA的交聯(lián)損傷起修復(fù)作用，對維持細(xì)胞染色體穩(wěn)定具有重要作用[2-3]。FANCD2蛋白泛素化被認(rèn)是FA DNA損傷修復(fù)通路中重要的激活步驟[2]，近年來其在腫瘤中作用的研究越來越多。我們的前期研究已經(jīng)證明在結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中通過siRNA干擾RAD18，可抑制FANCD2蛋白泛素化并增強(qiáng)其對絲裂霉素的敏感性[4]，表明RAD18在SW480細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)FANCD2泛素化的功能。但RAD18對FANCD2蛋白的調(diào)節(jié)作用是直接還是間接以及作用位點如何都有待進(jìn)一步研究。本實驗采用免疫共沉淀技術(shù)以及GST pull-down技術(shù)對兩者間的相互作用關(guān)系進(jìn)行初步驗證。

材料與方法

一、主要材料

結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)消化病研究所提供并由本實驗室保存，pGEX-4T-RAD18重組表達(dá)載體和pGEX-4T-1質(zhì)粒均由廣州紐克利公司負(fù)責(zé)構(gòu)建并經(jīng)測序鑒定正確，BL21感受態(tài)細(xì)胞購自廣州微科生物技術(shù)有限公司。RAD-18抗體、FANCD2抗體由Santa Cruz公司提供，兔IgG抗體、瓊脂糖珠子、HRP二抗由Bioworld公司提供。GST融合蛋白純化珠由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：SW480細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/L鏈霉素的RPMI-DMEM高糖培養(yǎng)基中，按時傳代培養(yǎng)。

2. 蛋白提?。杭?xì)胞傳代后培養(yǎng)于直徑10 cm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%左右，以預(yù)冷的PBS洗滌2～3次，吸干PBS后再將其刮下，并以適量PBS沖洗。吸取沖洗液置離心管于2 000 r/min離心3 min，棄上清。培養(yǎng)皿加入1 mL含苯甲基磺酰氟(PMSF)的細(xì)胞裂解液，冰上震蕩裂解15 min。收集裂解產(chǎn)物于1.5 mL離心管，14 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清。BCA法行蛋白定量后，將蛋白分為兩份，分別用于蛋白質(zhì)印跡檢測和免疫共沉淀以及反向免疫共沉淀。

3. 免疫共沉淀：將裂解液分成三等份，1份加入10 μL兔IgG抗體作為陰性對照，1份不加抗體作為空白對照，1份加入10 μL FANCD2抗體，搖床4 ℃孵育過夜，每份加入100 μL的瓊脂糖珠子，搖床4 ℃孵育6 h，2 000 r/min 離心2 min，去上清，以1.5 mL預(yù)冷的PBS反復(fù)離心洗5次，去上清，以5×上樣緩沖液20 μL于100 ℃變性10 min，2 000 r/min離心3 min，收集上清，于-20 ℃保存，用于10% SDS-PAGE電泳。

4. 反向免疫共沉淀：將用于反向免疫共沉淀的裂解液分成三等份，其中1份加入10 μL兔 IgG抗體作為陰性對照，1份不加抗體作為空白對照，1份加入10 μL FANCD2抗體行反向免疫共沉淀。

5. 蛋白質(zhì)印跡法：將細(xì)胞裂解液以及免疫共沉淀方法收集的沉淀產(chǎn)物電泳，一抗RAD18抗體1∶500稀釋，F(xiàn)ANCD2抗體1∶1 000稀釋，HRP標(biāo)記的二抗1∶5 000稀釋，ECL化學(xué)發(fā)光，用Vilber凝膠圖像成像儀采集圖像。

6. 重組體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：①將BL21感受態(tài)細(xì)胞在冰浴上融化，取50 μL加入無菌EP管中，加入1 μL目的基因，混勻，冰浴中放置30 min。②將EP管于42 ℃水浴中熱激活45 s，然后快速轉(zhuǎn)移至冰浴中25 min，期間勿搖動EP管。③向EP管中加入500 μL的LB培養(yǎng)液，混勻后置于37 ℃，200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)1 h，使細(xì)菌復(fù)蘇。④吸取EP管中的培養(yǎng)液將其均勻鋪在含有氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并置于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜直至培養(yǎng)皿上出現(xiàn)肉眼可見的菌落。⑤挑取單克隆菌落置含4 mL LB培養(yǎng)液的離心管中，培養(yǎng)菌液置波長600 nm 處測吸光度(A)值為0.4～0.6。⑥EP管中加入1 mL甘油，分裝，部分細(xì)菌樣品置-80 ℃冰箱保存，部分送上海英駿生物技術(shù)公司測序。

7. 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：①分別將測序正確的重組菌(pGEX-4T-RAD18)和對照菌(pGEX-4T-1)解凍，按1∶100接種至10 mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)基的離心管中，260 r/min， 37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。②培養(yǎng)菌液置波長600 nm處測A值為0.4～0.6，加入1 mol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)儲液至終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L，分別置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，搖床 260 r/min，培養(yǎng)12 h。③將離心管置于離心機(jī)中4 000 r/min 4 ℃離心10 min，收集細(xì)菌。④以PBS漂洗細(xì)菌沉淀，4 000 r/min 4 ℃離心10 min，分裝至1.5 mL離心管，置于-80 ℃保存。⑤取離心管中細(xì)菌沉淀，加入60 μL的PBS和20 μL蛋白上樣緩沖液，100 ℃金屬浴10 min，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法檢測融合蛋白的表達(dá)情況。

8. 融合蛋白提取和純化：①按照預(yù)實驗挑選最佳條件培養(yǎng)的重組菌(200 mL)，4 000 r/min離心15 min，去上清，分別加入1 mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)菌沉淀，并移入1.5 mL離心管，4 000 r/min離心10 min，反復(fù)此步驟2～3次。②將最后離心的上清去除，吸取200 μL細(xì)菌裂解液、20 μL PMSF和40 μL溶菌酶液將沉淀重懸，放入37 ℃水浴箱中孵育30 min。③將試管放入搖床中200 r/min 10 min，加入2 μL脫氧核糖核酸酶/核糖核酸酶(D/RNase酶)，繼續(xù)放入搖床中37 ℃搖10 min。④將離心管放入4 ℃冷凍離心機(jī)中，12 000 r/min離心10 min，取上清。⑤分別在融合蛋白GST-RAD18和陰性對照GST中加入50 μL GST融合蛋白純化珠，將1.5 mL離心管置4 ℃冰箱轉(zhuǎn)子中孵育過夜。⑥將離心管放入4 ℃冷凍離心機(jī)，4 000 r/min離心5 min，棄上清。⑦以無菌預(yù)冷的1 mL PBS重懸GST純化珠，將離心管放入4 ℃冷凍離心機(jī)中，4 000 r/min離心5 min，棄上清，反復(fù)3次。⑧向最后剩下的GST純化珠加入適量的蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，進(jìn)行Bradford染色，檢驗蛋白純化情況。

9. GST pull-down 實驗：①將提取的細(xì)胞總蛋白加入純化過的GST融合蛋白純化珠中，置4 ℃冰箱轉(zhuǎn)子中孵育6 h；②將孵育的純化融合蛋白從轉(zhuǎn)子上取出，3 000 r/min 4 ℃離心2 min，棄上清液，加入1.5 mL預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液，漂洗離心，棄上清。上述過程重復(fù)3次；③加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃金屬浴加熱10 min，迅速置于冰上，室溫 2 000 r/min離心3 min，用于蛋白質(zhì)印跡檢測。

結(jié) 果

一、免疫共沉淀和反向免疫共沉淀

在以FANCD2抗體免疫共沉淀下來的蛋白復(fù)合物中可檢測到微弱的RAD18蛋白(圖1)。在以RAD18抗體免疫共沉淀下來的蛋白復(fù)合物中可檢測到FANCD2蛋白(圖2)。

二、融合蛋白的表達(dá)

IPTG濃度為0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L誘導(dǎo)的菌液中均可見RAD18的表達(dá)。應(yīng)用Quantity One軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，在IPTG濃度為0.4 mmol/L時RAD18的表達(dá)最高(圖3)。

泳道1：加入FANCD2抗體的免疫沉淀；泳道2：SW480細(xì)胞裂解原液；泳道3：兔 IgG抗體陰性對照；泳道4：瓊脂糖珠子空白對照

泳道1：SW480細(xì)胞裂解原液；泳道2：加入RAD18抗體的免疫沉淀；泳道3：兔 IgG抗體陰性對照；泳道4：瓊脂糖珠子空白對照

圖3 融合蛋白表達(dá)電泳圖

三、融合蛋白提取和純化

在70～100 kDa(1 Da=0.992 1 u)之間，泳道3(箭頭處)可見深染的蛋白條帶，證明純化有效(圖4)。

泳道1：SW480細(xì)胞裂解液；泳道2：蛋白Marker；泳道3：純化后的細(xì)菌裂解液；泳道4：誘導(dǎo)后的細(xì)菌裂解液

四、GST pull-down 實驗

用細(xì)菌表達(dá)的GST-RAD18蛋白作誘餌蛋白時，可捕獲結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中的FANCD2蛋白(圖5)。

泳道1：GST pull-down組；泳道2：SW480細(xì)胞裂解液；泳道3：GST陰性對照

討 論

目前，有研究顯示在人類骨肉瘤細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)RAD18能通過E3泛素連接酶活性調(diào)節(jié)FANCD2單泛素化和FANCD2核灶區(qū)的形成[2,5]。我們的前期研究已表明RAD18在SW480細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)FANCD2泛素化的功能[4]。但RAD18對FANCD2泛素化具體的調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚。

本研究中，我們通過使用目的蛋白抗體結(jié)合目的蛋白并加瓊脂糖珠子沉淀抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)過反復(fù)洗滌，最終獲得的復(fù)合物中主要含有抗體、目的蛋白、瓊脂糖珠子以及其他一些非特異性結(jié)合蛋白。在復(fù)合物中加入上樣緩沖液進(jìn)行煮沸變性后，通過離心可除去瓊脂糖珠子，上清液中便只有抗體和目的蛋白復(fù)合物以及少量非特異性吸附蛋白。由于上樣緩沖液中的二硫蘇糖醇(DTT)會導(dǎo)致抗體重鏈與輕鏈之間的二硫鍵被破壞，從而使抗體分子變成重鏈分子(分子量為 50 kDa)和輕鏈分子(分子量為 25 kDa)[6]，實驗中通過加入兔IgG陰性對照以及不加抗體的空白對照可排除這些干擾，反向?qū)嶒炦M(jìn)一步驗證了結(jié)果的可靠性。GST pull-down實驗是一種體外驗證蛋白之間相互作用的方法，有一定的假陽性。Wissmueller等[7]報道GST標(biāo)簽會使KLF3蛋白部分不能正確折疊，并使KLF3和GATA-1出現(xiàn)假陽性結(jié)果，所以GST pull-down的結(jié)果如果不能用其他方法證實，其可信度還有待商榷。但結(jié)合免疫共沉淀實驗我們可以確信兩種蛋白之間確實存在相互作用。

目前，對于RAD18的結(jié)構(gòu)研究比較清楚，包含有5個不同的結(jié)構(gòu)域：RING位點、UBZ位點、 SAP位點、 RAD6結(jié)合位點以及DNA聚合酶結(jié)合位點。

RAD18蛋白可以通過1個保守的環(huán)指狀亞基與RAD6相互作用。RAD6A和RAD6B與RAD18組成復(fù)合體共同泛素化PCNA164位點上的賴氨酸，并且環(huán)指狀亞基的突變會引起DNA損傷修復(fù)的缺陷以及對誘變劑的高敏感性[8]。可以推測RAD18有可能通過類似泛素PCNA的方式使FANCD2泛素化，從而可以通過構(gòu)建局部結(jié)構(gòu)域缺失的重組RAD18蛋白，進(jìn)一步研究RAD18與FANCD2蛋白之間的作用位點。

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