季寅寅，江震宇，朱 晨，張佳艷，周珊珊，徐麗珊

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

酪氨酸酶是目前已知的生物體內(nèi)合成黑色素的關(guān)鍵酶[1]，它與人體膚色以及雀斑、褐斑等黑色素過(guò)度沉積的疾病發(fā)生有關(guān)[2]。在黑色素細(xì)胞內(nèi)，酪氨酸在酪氨酸酶作用下氧化為多巴、多巴醌，多巴醌經(jīng)一系列的反應(yīng)，最終合成黑色素[3]，因此，可以通過(guò)抑制酪氨酸酶活性阻斷黑色素合成。而植物源酪氨酸酶抑制劑在化妝品領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[4-6]，熊果苷就是一種目前市場(chǎng)上廣泛使用的通過(guò)抑制酪氨酸酶活性以達(dá)到美白效果的植物源美白劑[7]。另外，研究表明，酪氨酸酶抑制劑可以防止果蔬褐化[8]，影響昆蟲(chóng)的蛻皮[9]。

我國(guó)松屬資源豐富，南方地區(qū)種植了大面積的濕地松（Pinus elliottii Engelm.），形成了多個(gè)人工濕地松林區(qū)。濕地松具有良好的適應(yīng)性和抗逆力，其松針是一種可持續(xù)的再生性資源，儲(chǔ)備量大，無(wú)毒，但目前還沒(méi)有得到很好的開(kāi)發(fā)利用[10]。

本研究以濕地松松針為原料，優(yōu)化酪氨酸酶抑制劑的提取工藝。研究結(jié)果可以為開(kāi)發(fā)濕地松松針源酪氨酸酶抑制劑，并使其進(jìn)一步應(yīng)用于化妝品、食品和藥物領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 島津UV-2550紫外分光光度計(jì)（島津制作所）、水浴鍋（上海愛(ài)朗儀器有限公司）、DZF-6050B真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）、BPG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、CT 15RE日立臺(tái)式離心機(jī)、pH計(jì)。

1.1.2 主要試劑 酪氨酸酶（日本W(wǎng)ako公司）、L-酪氨酸（上海寶曼生物科技有限公司）、熊果苷（上海寶曼生物科技有限公司）。

1.1.3 試驗(yàn)材料 供試材料為濕地松（Pinus elliottii Engelm.）松針。

1.2 方法

1.2.1 酪氨酸酶活性及抑制能力的測(cè)定 在酪氨酸酶催化反應(yīng)生成黑色素的過(guò)程中，酪氨酸酶的催化反應(yīng)主要發(fā)生在酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴以及多巴轉(zhuǎn)化為多巴醌這2個(gè)階段[11]。多巴醌是紅色物質(zhì)，在一定波長(zhǎng)下（475 nm）有最大吸收，可進(jìn)行測(cè)定[12]，在一定范圍內(nèi)，紅色的深淺與多巴醌含量的多少成正比，單位時(shí)間多巴醌的生成量可用來(lái)表示酪氨酸酶的活性。在相同條件下，加入抑制劑，以多巴醌的減少量表示對(duì)酪氨酸酶的抑制能力。

L-酪氨酸溶液、酶溶液均用0.2 mol/L，pH值為6.8的磷酸緩沖溶液配制。按表1準(zhǔn)確吸取A，B，C，D組反應(yīng)液，在37℃水浴中充分反應(yīng)，6 min時(shí)于475 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)，按公式（1）計(jì)算抑制率。

表1 酪氨酸酶催化反應(yīng)混合體系 μL

式中，A475B為底物與酪氨酸酶反應(yīng)6 min時(shí)的吸光值；A475D為底物與酪氨酸酶在抑制劑存在下體系反應(yīng)6 min時(shí)的吸光值。

1.2.2 抑制酪氨酸酶活性成分提取的單因素試驗(yàn)稱取一定量烘干的濕地松松針，按單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)[13]（料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25）、乙醇濃度（0，25%，50%，75%，100%）、浸提溫度（20，40，60，80，100 ℃）、浸提時(shí)間（0.5，1，2，3 h））進(jìn)行提取，提取液經(jīng)抽濾后定容至5 mg/mL（以濕地松松針的干質(zhì)量計(jì)），測(cè)定其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制能力。

1.2.3 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以濕地松松針提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率為目標(biāo)函數(shù)，根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果選取主要影響因素，采用Design-Expert 8.05b統(tǒng)計(jì)軟件中的Box-Benhnken（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

以濕地松松針為原料，考察料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)提取液的酪氨酸酶抑制活性的影響（圖 1）。

由圖1可知，料液比、乙醇濃度、浸提溫度對(duì)濕地松松針中酪氨酸酶抑制成分提取的影響較為明顯，分別在料液比為1∶15、乙醇濃度為50%、提取溫度為80℃時(shí)抑制率達(dá)到最大。對(duì)乙醇濃度進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)化試驗(yàn)得知，乙醇濃度為60%時(shí)的抑制率大于50%時(shí)的抑制率。隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，濕地松松針粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用增大，提取時(shí)間為1 h時(shí)的抑制率顯著高于0.5 h，而1，2 h間差異不顯著，為了提高效率，選擇的浸提時(shí)間為1 h。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果確定料液比、乙醇濃度和提取溫度為擬合因素。試驗(yàn)擬合因素編碼以及水平[15]列于表2。

表2 試驗(yàn)擬合因素編碼及水平

以濕地松松針提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，含4個(gè)中心點(diǎn)重復(fù)，得到結(jié)果如表3所示。

二次響應(yīng)面回歸模型為：抑制率（%）＝61.95＋4.21×A－4.65×B＋15.57×C－1.85×A×B＋3.57×A×C－0.99×B×C＋2.05×A2－5.81×B2－22.83×C2。

方差分析結(jié)果列于表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 響應(yīng)面二次模型及其回歸系數(shù)的方差分析結(jié)果

從表4可以看出，3個(gè)因素對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響都很顯著，影響程度從大到小依次為提取溫度、乙醇濃度、料液比；且響應(yīng)回歸模型為極可信，試驗(yàn)結(jié)果能與回歸方程良好地?cái)M合，各擬合因素間并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的相關(guān)系數(shù) R2＝4 724.33/4 733.86＝0.998＞0.8，說(shuō)明抑制率實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，因此，該模型可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)濕地松松針提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制效果。

2.2.2 交互擬合因素效應(yīng)分析 提取溫度、料液比、乙醇濃度3個(gè)因素之間的交互效應(yīng)如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，料液比與溫度對(duì)酪氨酸酶抑制率的交互影響作用不明顯；當(dāng)料液比為1∶15時(shí)，乙醇濃度與溫度對(duì)酪氨酸酶抑制率的交互影響作用極顯著；當(dāng)溫度為80℃時(shí)，料液比與乙醇濃度對(duì)酪氨酸酶抑制率的交互影響明顯。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 利用Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行最優(yōu)化分析，以濕地松松針提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率為指標(biāo)，確定最佳提取條件為：料液比1∶18，乙醇濃度54.04%，溫度84.32℃，預(yù)測(cè)在此條件下，所得濕地松松針提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率為74.27%，提取物得率為21.43%。

考慮到實(shí)際情況，在驗(yàn)證試驗(yàn)中將最優(yōu)提取條件調(diào)整為：料液比1∶18，乙醇濃度55%，浸提溫度85℃。驗(yàn)證3次，測(cè)得濕地松松針提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率為70.67%±1.08%，與預(yù)測(cè)值間無(wú)顯著差異，表明采用該模型優(yōu)化的工藝參數(shù)具有可行性。

2.3 濕地松松針粗提物的酪氨酸酶抑制活性

測(cè)定不同質(zhì)量濃度濕地松松針提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率，且與陽(yáng)性對(duì)照熊果苷進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著濕地松松針提取物、熊果苷質(zhì)量濃度的增加，酪氨酸酶抑制率增加，二者的IC50值分別為 0.91，0.74 mg/mL。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)及3因素3水平響應(yīng)面法分析，得到響應(yīng)值與各因素間的數(shù)學(xué)模型。根據(jù)模型可知，各因素對(duì)提取結(jié)果的影響大小順序?yàn)椋禾崛囟龋疽掖紳舛龋玖弦罕?。確定濕地松松針中酪氨酸酶抑制劑提取的最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶18，乙醇濃度55%，溫度85℃，提取液對(duì)酪氨酸酶的抑制率達(dá)70.67%。濕地松松針的提取物的得率為21.43%，對(duì)酪氨酸酶抑制率的IC50值為0.91 mg/mL。

本試驗(yàn)利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化濕地松松針酪氨酸酶抑制劑提取的提取工藝，可為開(kāi)發(fā)濕地松松針源酪氨酸酶抑制劑，并將其進(jìn)一步應(yīng)用于化妝品、食品和藥物領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

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