徐磊，白俊杰，李勝杰，孫成飛

(1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣東廣州 510380;2上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

生長相關(guān)優(yōu)勢基因型在大口黑鱸‘優(yōu)鱸1號’選育世代中的聚合

徐磊1，2，白俊杰1，李勝杰1，孫成飛1

(1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣東廣州 510380;2上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

【目的】以先前研究所獲得的8個與大口黑鱸生長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記為檢測目標(biāo)，分析其優(yōu)勢基因型在大口黑鱸選育群體中的分布數(shù)量，探索生長相關(guān)分子標(biāo)記應(yīng)用于大口黑鱸基因聚合育種的潛在可行性.【方法】采用STR基因分型技術(shù)對大口黑鱸‘優(yōu)鱸1號’F2、F3、F5和F6選育群體的生長標(biāo)記基因型進行檢測，8個生長標(biāo)記中含有4個單核苷酸多態(tài)性位點(分別位于IGF-I、POU1F1、PSSⅢ和MSTN基因上)和4個微衛(wèi)星位點(分別是JZL60、JZL67、MisaTpw76和MisaTpw117).【結(jié)果和結(jié)論】試驗魚所含優(yōu)勢基因型的數(shù)量為0～6個，F(xiàn)2、F3、F5和F6選育群體中優(yōu)勢基因型的分子標(biāo)記平均數(shù)量依次為2.12、2.70、2.90和3.08，呈現(xiàn)逐代遞增趨勢;優(yōu)勢基因型的分子標(biāo)記數(shù)量與大口黑鱸生長速度呈同步遞增趨勢，說明人工選育在一定程度上聚合了優(yōu)勢基因.

優(yōu)勢基因型;聚合;STR;基因分型;大口黑鱸;選育

分子標(biāo)記輔助選擇(Marker associated selection，MAS)是利用分子標(biāo)記在基因水平上對選擇個體進行篩選，提高了選擇育種的準(zhǔn)確性與效率［1］.近年來隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，使基于分子標(biāo)記的數(shù)量性狀位點(Quantitative trait locus，QTL)的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)成為現(xiàn)實.魚類的生長性狀屬于數(shù)量性狀，是育種研究的一個重要指標(biāo)，目前已經(jīng)有研究報道了與生長相關(guān)的各種類型分子標(biāo)記，如：黑龍江水產(chǎn)研究所對鯉魚體長性狀的研究發(fā)現(xiàn)有3個基因位點HLJ534、HLJ370、HLJ319可能與鯉魚生長相關(guān)［2］.珠江水產(chǎn)研究所對草魚生長性狀的研究發(fā)現(xiàn)有1個生長性狀的候選SNP標(biāo)記［3］，有待于將分子標(biāo)記輔助育種在實踐中實現(xiàn)應(yīng)用.

基因聚合最早由Yadav等［4］在研究芥菜抗病和抗逆性狀改良時提出，許多研究者嘗試開展數(shù)量性狀的基因聚合研究，期望通過基因聚合技術(shù)加快育種進程.對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎性狀的研究中發(fā)現(xiàn)，與抗該病相關(guān)的SNP標(biāo)記優(yōu)勢基因型聚合的人，患病幾率較低［5］.對雞的肌內(nèi)脂肪含量的性狀研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢基因型聚合個體的肌內(nèi)脂肪含量明顯較高［6］.于吉英等［7］和李國輝等［8］對雞產(chǎn)蛋以及Li等［9］對波爾山羊產(chǎn)仔性狀的研究中均發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢基因型聚合對性狀改良有促進作用.目前關(guān)于生長相關(guān)基因聚合的研究鮮見報道，在中國美利奴羊［10］和淮豬［11］的研究中顯示，與生長性狀關(guān)聯(lián)的優(yōu)勢基因型聚合程度越高，性狀表現(xiàn)越優(yōu)良;孫效文等［12］研究發(fā)現(xiàn)10尾極大個體中含有的生長相關(guān)優(yōu)勢基因型的數(shù)量要多于10尾極小個體.珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室已經(jīng)獲得大口黑鱸Micropterus salmoides8個生長相關(guān)分子標(biāo)記，與生長呈顯著或極顯著相關(guān)，其中4個單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點分別位于胰島素樣生長因子-Ⅰ(Insulin-like growth factor-Ⅰ)5'側(cè)翼區(qū)域［13］、垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子(Pituitary specific transcription factor1)啟動子、生長抑素前體(Preprosomatostatin)啟動子［14］和肌肉生長抑制素(Myostatin)［15］基因上，4個微衛(wèi)星DNA位點分別為JZL60、JZL67、MisaTpw76和MisaTpw117［16］，有必要探索它們的聚合效應(yīng)，進而對其有更好的利用.

大口黑鱸自20世紀(jì)80年代被引入我國，已成為主要的淡水經(jīng)濟養(yǎng)殖品種之一.針對大口黑鱸養(yǎng)殖群體出現(xiàn)的種質(zhì)退化問題［17］，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所經(jīng)多年選育，培育出生長性狀改良的優(yōu)良養(yǎng)殖品種‘優(yōu)鱸1號’，已通過全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定.‘優(yōu)鱸1號’比普通養(yǎng)殖大口黑鱸生長速度提高17.8%～25.3%［18］.本研究利用已經(jīng)獲得的8個大口黑鱸生長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記來分析大口黑鱸選育世代含有的優(yōu)勢基因型的變化規(guī)律，研究結(jié)果可以為下一步生長性狀相關(guān)標(biāo)記的聚合選育提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大口黑鱸‘優(yōu)鱸1號’是被審定的國家級養(yǎng)殖新品種，試驗所用的大口黑鱸選育魚F6取自珠江水產(chǎn)研究所良種基地，F(xiàn)2、F3和F5均來源于珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點開放實驗室已保存樣本.從選育群體的F2、F3、F5和F6中各隨機選擇30尾成魚取尾鰭組織，提取樣品基因組DNA(在連續(xù)選育過程中，前一世代群體為后一世代群體的親本).各個位點PCR反應(yīng)所用的引物均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品，并用熒光進行標(biāo)記(表1).TIANamp Genomic DNA Kit為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品.TaqDNA聚合酶，Buffer和dNTP為華美生物工程公司產(chǎn)品.限制性內(nèi)切酶TaqI、BsrBI和AluI為Fermentas公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司試劑盒說明書提取大口黑鱸鰭條組織的總DNA.8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度，保存于-20℃條件下備用.

1.2.2 PCR擴增在PCR擴增之前，引物用FAM、ROX或HEX熒光來進行標(biāo)記.PCR反應(yīng)總體積為20 μL，含有10×Buffer 2.0 μL，MgCl2(25 mmol/L) 0.8 μL;dNTP(10 μmol/L)0.4 μL;上下游引物(20 μmol/L)各0.4 μL;基因組DNA(40 ng)1 μL; dd H2O 15.0 μL，Taq酶(上海申能博彩生物科技有限公司)1 U.PCR擴增程序：94℃預(yù)變性4 min;然后94℃變性30 s，48～63℃退火30 s，72℃延伸30 s，32個循環(huán);最后72℃再延伸10 min.

表1 大口黑鱸生長性狀相關(guān)分子標(biāo)記引物信息Tab.1 Primers of growth-related markers of largemouth bass

1.2.3 擴增產(chǎn)物檢測短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat，簡稱STR)基因分型委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成，使用DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海琪特分析儀器有限公司)、凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius公司)和3730XL測序列分析儀(美國ABI公司)進行STR序列分析，根據(jù)每個擴增條帶的相對分子質(zhì)量的差異性，判斷每尾魚中各個位點的基因型.其中4個微衛(wèi)星位點和IGF-Ⅰ基因上片段缺失的突變位點直接用STR基因分型技術(shù)分析基因型，位于POU1F1、PSSⅢ和MSTN基因上的3個SNP位點分別需要經(jīng)過限制性內(nèi)切酶TaqⅠ、BsrBⅠ和AluⅠ酶切后再使用STR基因分型.

1.2.4 統(tǒng)計指標(biāo)通過STR基因分型技術(shù)確定每個個體在各個位點的基因型，計算出每個世代選育群體中每一個位點上的優(yōu)勢基因型的頻率(x)和各個選育世代中優(yōu)勢基因型的平均數(shù)量和分布.各個世代中優(yōu)勢基因型的數(shù)量計算公式：ˉx=∑xifi/∑fi.式中，ˉx為8個優(yōu)勢基因型的平均數(shù)量;xi為第i個優(yōu)勢基因型頻率;fi為第i個優(yōu)勢基因型所對應(yīng)的大口黑鱸檢測數(shù)量.

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)勢基因型的分子標(biāo)記的檢測

試驗采用STR基因分型技術(shù)對大口黑鱸8個生長相關(guān)分子標(biāo)記進行檢測，結(jié)果顯示：隨人工選育的推進，F(xiàn)2、F3、F5和F6中，只含有2個優(yōu)勢基因型的分子標(biāo)記的個體數(shù)量逐漸減少，而含有4個優(yōu)勢基因型的分子標(biāo)記的個體數(shù)量逐漸增多(表2).在F2、F3和F5中，每個優(yōu)勢基因型頻率的分析結(jié)果顯示，除PSSⅢ和POU1F1優(yōu)勢基因型的頻率有波動之外，其他優(yōu)勢基因型的頻率是逐漸升高的(表3).

表2 選育世代中不同優(yōu)勢基因型數(shù)量的樣本分布Tab.2 The distribution of sample with different dominant genotypes of each generation尾

2.2 優(yōu)勢基因型在各個世代的數(shù)量及分布

根據(jù)大口黑鱸‘優(yōu)鱸1號’F2、F3、F5和F6中各個優(yōu)勢基因型的分布進行統(tǒng)計，得到每個世代中8個優(yōu)勢基因型的平均數(shù)量.結(jié)果顯示：‘優(yōu)鱸1號’F2、F3、F5和F6選育群體中優(yōu)勢基因型的分子標(biāo)記平均數(shù)量依次為2.12、2.70、2.90和3.08，呈現(xiàn)逐代遞增趨勢，說明人工選育使生長優(yōu)勢基因得到聚合，隨著‘優(yōu)鱸1號’F2、F3、F5和F6生長速度的提高，生長優(yōu)勢標(biāo)記的平均數(shù)量也同步遞增.

表3‘優(yōu)鱸1號’各世代中的優(yōu)勢基因型頻率Tab.3The advantage genotype’s frequency in each generation of‘You lu No.1’

3 討論

3.1 各個優(yōu)勢基因型對生長貢獻的差異分析

目前關(guān)于不同基因在基因聚合中貢獻率的差異報道仍然很少.本研究發(fā)現(xiàn)了在基因聚合中對大口黑鱸生長的貢獻率較大的生長相關(guān)優(yōu)勢基因型.對8個生長相關(guān)優(yōu)勢基因型的研究結(jié)果顯示：位于MSTN基因上的SNP位點和MisaTpw76位點上的優(yōu)勢基因型出現(xiàn)的頻率隨著‘優(yōu)鱸1號’生長速度的加快而逐代增大，其余6個優(yōu)勢基因型頻率在選育進程中有時增加，有時減小或不變.F2到F3，位于PSSⅢ基因上的SNP位點和JZL60位點的優(yōu)勢基因型頻率均未增加，其余位點的優(yōu)勢基因型頻率均有所增加;F3到F5，除位于PSSIII基因和POUIFI基因上的SNP位點與JZL60位點的優(yōu)勢基因型頻率沒有增加之外，其余位點的優(yōu)勢基因型頻率都增加;F5到F6，位于IGF-I基因和POUIFI基因上的SNP位點以及MisaT-pw117和JZL67位點的優(yōu)勢基因型頻率都下降，其余位點的優(yōu)勢基因型頻率均增大.從F2到F6，8個標(biāo)記中，只有MisaTpw76和位于MSTN基因的SNP位點的優(yōu)勢基因型頻率是逐漸上升的，推測這2個標(biāo)記對生長性狀的作用效果比較明顯.珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點開放實驗室之前的研究結(jié)果表明：MisaTpw76位點和位于MSTN基因上的優(yōu)勢基因型的個體分別比其他基因型的個體平均體質(zhì)量高46.18%［16］和53.24%［15］，其余6個標(biāo)記中優(yōu)勢基因型群體比自身位點的其他基因型群體的體質(zhì)量高16.86%～35.84%［13-14，16］，本研究獲得的結(jié)果與之基本相符.利用8個生長標(biāo)記來輔助親魚挑選時，位于基因MSTN上的SNP和MisaTpw76位點的優(yōu)勢基因型會比其余6個分子標(biāo)記具有更好的選擇效果，應(yīng)作為今后親魚篩選的主要標(biāo)記，用于大口黑鱸生長性狀改良.

3.2 人工選育對優(yōu)勢基因型數(shù)量變化的影響

目前，生長性狀與生長相關(guān)基因聚合的研究大多利用的是2個或3個位點，本文對生長性狀與多個生長相關(guān)優(yōu)勢基因型間的聯(lián)系進行探索，試驗結(jié)果顯示：大口黑鱸‘優(yōu)鱸1號’隨著選育世代的累進，優(yōu)勢基因型的平均數(shù)量也逐代遞增，這種現(xiàn)象與生長速度逐代提高的現(xiàn)象是吻合的，說明傳統(tǒng)的以形態(tài)和體質(zhì)量為指標(biāo)的選育也使優(yōu)勢基因型得到聚合.本研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢基因型的數(shù)量從F2到F3、F3到F5、F5到F6(F4保留樣品不足，本試驗未對其進行分析)的增加幅度依次為：0.58、0.20和0.18，增幅逐漸減小，這與選育群體目標(biāo)性狀逐漸趨向穩(wěn)定的觀測結(jié)果相一致.理論上講，人工選擇育種是把某些性狀逐漸選留下來，使性狀相關(guān)的基因型頻率增加，隨著選育世代的累進，基因的純合率就會上升，選擇的有效度就會下降，對表型和基因型頻率的改變幅度都會有所降低［19］，所以優(yōu)勢基因型的數(shù)量增幅就會降低.李愛民等［20］對魯西牛ANGPTL6基因的3個生長相關(guān)位點的研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢基因型數(shù)量的增加與生長性狀改良是同步的，可以應(yīng)用于魯西牛的分子育種實踐.趙廣泰等［21］對大黃魚選育世代的研究發(fā)現(xiàn)，有2個位點的基因頻率隨著選育世代的發(fā)展呈現(xiàn)有規(guī)律的增加，推測這2個位點可能與選育性狀存在相關(guān)性.本研究也發(fā)現(xiàn)，‘優(yōu)鱸1號’隨著選育世代的累進，優(yōu)勢基因型的平均數(shù)量是逐漸增加的，推測本研究所選的8個優(yōu)勢基因型在大口黑鱸中所含的數(shù)量多少可能與其生長快慢存在相關(guān)性.

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【責(zé)任編輯柴焰】

Pyramiding of growth-related genotypes in generations of the largemouth bass，Micropterus salmoides，‘Youlu No.1’

XU Lei1，2，BAI Junjie1，LI Shengjie1，SUN Chengfei1
(1 Pearl River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Tropical＆Subtropical Fishery Resource Application＆Cultivation，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510380，China; 2 College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

【Objective】Eight molecular markers related to growth traits were detected in the different breeding populations of largemouth bass，which had been found by previous studies.This would provide useful information for the actual application of limited growth markers in gene pyramiding breeding of largemouth bass.【Method】Using the technology of STR genotyping，genotype of 8 growth markers in the F2，F(xiàn)3，F(xiàn)5 and F6 generations of largemouth bass(Micropterus salmoides)，‘Youlu No.1’were detected and the number of advantage genotypes was analyzed.The growth markers included four sites of single nucleotide polymorphism located inIGF-I，POU1F1，PSSⅢandMSTNgene and four sites of microsatellite：JZL60，JZL67，MisaTpw76 andMisaTpw117.【Result and conclusion】The number of advantage genotypes was 0-6 in the tested fishes.The average number was 2.12，2.70，2.90 and 3.08 in F2，F(xiàn)3，F(xiàn)5 and F6 generations，respectively，presenting an increasing trend with each generation.The number of the advantage genotypes increased synchronously with the growth rate of the breeding large-mouth bass in different populations.This means that the artificial selection has polymerized the advantage genotype to some extent.

advantage genotype;enrichment;STR;genotyping;Micropterus salmoides;breeding

S917

A

1001-411X(2014)01-0007-05

徐磊，白俊杰，李勝杰，等.生長相關(guān)優(yōu)勢基因型在大口黑鱸‘優(yōu)鱸1號’選育世代中的聚合［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，35(1)：7-11.

2013-03-29優(yōu)先出版時間：2013-11-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1500.005.html

徐磊(1987—)，男，碩士研究生，E-mail:xlkuaile@126.com;通信作者:白俊杰(1957—)，男，研究員，碩士，E-mail:jjbai@163.net

國家自然科學(xué)基金(31201985);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200903045);國家科技支撐計劃(2012BAD26B03)