蘇進(jìn)展，王想蘭，馮世秀，王曉明，胡章立，陳 濤

(1.廈門日懋城建園林建設(shè)股份有限公司，福建 廈門 361101；2.深圳市中國科學(xué)院仙湖植物園,廣東 深圳 518004；3.深圳大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 深圳 518060；4.深圳市日昇園林綠化有限公司，廣東 深圳 518034)

葉子花屬(Bougainvillea)植物是紫茉莉科(Nyctaginaceae)多年生灌木或喬木，有10余種，原產(chǎn)南美洲。栽培品種豐富，苞片顏色極其艷麗多樣，有單瓣與重瓣之分，是熱帶亞熱帶地區(qū)的重要觀賞植物，也是研究花色變異和表達(dá)的優(yōu)良材料[1]。重瓣葉子花早在20世紀(jì)60年代就陸續(xù)在菲律賓培育出來，苞片有紅色、粉紅色和橙色等[2,3],后在印度進(jìn)一步培育出花葉重瓣品種[4]。

與其他紫茉莉科和大多數(shù)石竹目(Caryophyllales)植物一樣，葉子花的苞片色素主要是甜菜色素(Betalain)。甜菜色素是一類植物次生代謝產(chǎn)生的生物堿，主要包括甜菜紅素和甜菜黃素[5]。形成甜菜色素的代謝途徑主要由DOPA4,5-雙加氧酶(DOD)催化調(diào)控[6]。研究發(fā)現(xiàn)，編碼與葉子花同科的紫茉莉(Mirabilisjalapa)的DOD cDNA序列(MjDOD,AB435372.1)，與甜菜(Betavulgaris：BvDOD,AJ583017)有67%的相似度，與大花馬齒莧(PhytolacagrandifloraPgDOD,AJ580598)的相似度為63%[7,8]。

光葉子花(BougainvilleaglabraBgDOD,AB435373.1)苞片的DOPA4,5-雙加氧酶cDNA全長1 078 bp，具有一個870 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼268個氨基酸[8]。研究根據(jù)光葉子花DOD cDNA序列和蛋白質(zhì)序列(BAG80687.1)設(shè)計(jì)了一對葉子花DOD基因的特異性開放閱讀框引物BdodF/R，以具有不同苞片顏色的5個重瓣葉子花品種為材料，通過反轉(zhuǎn)錄克隆其DOD基因的開放閱讀框序列，經(jīng)序列比對來探討DOD基因與葉子花苞片不同顏色表達(dá)之間的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 材料

研究材料選擇苞片都是重瓣但顏色各不同或具花葉的5個重瓣葉子花栽培品種(表1)。各品種的花苞片均采自廣東省深圳市仙湖植物園葉子花保育與研發(fā)基地，用液氮取樣固定保存，供RNA提取。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

采用新拓?fù)渖锟萍加邢薰镜男滦椭参锟俁NA提取試劑盒提取5個不同重瓣葉子花品種苞片的RNA(具體操作見NeoTopTMplant Total RNA Isolation Kit)，以30 μL DEPC水溶解，于-80 ℃冰箱保存待用。取1 μL總RNA為模板，Random 6 mers為引物合成單鏈cDNA (具體操作見PrimerScriptTM1stStrand cDNA Kit)，置于-20 ℃冰箱保存待用。

表1 供試RNA提取的樣品材料Table 1 Material for RNA extraction

1.3 DOD基因開放閱讀框克隆

根據(jù)光葉子花DOD基因cDNA序列(BgDOD,AB435373.1)和氨基酸序列(BAG80687.1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司引物設(shè)計(jì)部設(shè)計(jì)和合成1對包含開放閱讀框序列的特異性引物，預(yù)期引物長度870 bp。所設(shè)計(jì)的引物序列為：BdodF：5′-ATGGGT GGGGAGAAAAAAATG-3′，BdodR：5′-CCAGA AAAAGCAAACACAAGAAG-3′。取1μL上述合成的單鏈cDNA為模板，BdodF/R為特異性引物PCR擴(kuò)增cDNA序列，反應(yīng)條件94 ℃ 4 min變性，94 ℃ 30 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，20個循環(huán)，每一個循環(huán)降1 ℃，94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，20個循環(huán)，72 ℃ 7 min，于4 ℃下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送InvitrogenTM廣州公司測序。

1.4 DOD基因序列同源性和相似性分析比較

通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得不同葉子花品種的DOD cDNA序列，采用軟件ClustalX 2.0[9]進(jìn)行同源性分析，并將序列數(shù)據(jù)在NCBI基因庫中進(jìn)行Blast相似性檢索，應(yīng)用軟件Mega5[10 ]對近緣物種進(jìn)行相似性分析，采用最大似然法(Maximum Likelihood Method,ML)構(gòu)建相似性關(guān)系樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DOD基因的PCR擴(kuò)增

5個不同葉子花品種的DOD cDNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增后獲得了特異性產(chǎn)物(圖1)。這些條帶介于700～1 000 bp，與預(yù)期長度相符。

圖1 5個葉子花栽培品種DOD基因cDNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測Fig.1 Detection of DOD cDNA of five Bougainvillea cultivars from PCR amplification

2.2 DOD基因同源性比較

應(yīng)用軟件ClustalX 2.0對5個重瓣葉子花品種的不同顏色苞片的DOD cDNA序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示其序列基本相同，同源性達(dá)100%(圖2)。這些親緣關(guān)系密切的栽培品種，雖然其苞片顏色不同，但調(diào)控色素合成的功能基因并沒有差異。因此，重瓣葉子花品種的苞片顏色與DOD基因的表達(dá)似乎沒有直接關(guān)聯(lián)，而應(yīng)由其他功能基因調(diào)控。

2.3 DOD基因相似性分析

將轉(zhuǎn)錄組測序獲得5個品種的DOD cDNA序列數(shù)據(jù)與NCBI基因庫中近緣種進(jìn)行Blast相似性檢索，重瓣葉子花品種的DOD cDNA序列與光葉子花的(BgDOD)相似度達(dá)99%，與紫茉莉的(MjDOD)達(dá)84%，與甜菜(BvDOD)達(dá)70%，與大花馬齒莧(PgDOD)達(dá)67%。基于DOD基因序列運(yùn)用Mega5軟件和最大似然法(ML)對葉子花不同重瓣栽培品種及其近緣種進(jìn)行相似性分析(圖3)。

圖3 重瓣葉子花栽培品種及其近緣種DOD基因同源性分析Fig.3 Homologous analysis of multi-bracted Bougainvillea cultivars and their close relatives

3 討論

葉子花的苞片色彩多樣，但迄今尚未見有真藍(lán)色。不同色彩苞片的葉子花品種的色素生物合成調(diào)控基因序列的比對及其與苞片顏色差異表達(dá)的規(guī)律分析，對于新花色品種的分子育種具有重要價值。甜菜堿是紫茉莉科、莧科、藜科等大多數(shù)石竹目植物花果等器官顏色的主要色素。甜菜色素在植物不同器官中的含量和分布規(guī)律與顏色的表達(dá)密切相關(guān)。DOPA4,5-雙加氧酶(DOD)是甜菜色素生物合成過程中的關(guān)鍵酶，對研究花色表達(dá)調(diào)控至關(guān)重要[11]。從花色不同的大花馬齒莧、甜菜、紫茉莉和光葉子花中克隆的DOD基因，其序列均有不同程度的差異。試驗(yàn)中的5個重瓣葉子花品種具有共同的來源，都是來自巴特葉子花(Bougainvillea×buttiana)的栽培品種。雖然這幾個品種各具有不同顏色的苞片，但調(diào)控其色素合成的DOD基因cDNA序列卻完全相同，表明不同苞片顏色的表達(dá)與DOD基因?qū)ι睾铣傻恼{(diào)控可能并非直接相關(guān)。甜菜色素是甜菜醛氨酸與不同氨基酸結(jié)合的衍生物，在植物體中表現(xiàn)為紅色、紫色和黃色等多種顏色，主要包括甜菜紅素和甜菜黃素兩種形式，且可隨pH值變化而轉(zhuǎn)變[12]。因此，形成葉子花品種不同苞片豐富色彩的物質(zhì)基礎(chǔ)及其表達(dá)調(diào)控值得進(jìn)一步深入研究。

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