向 華，南麗麗，李春曉，王克婧，杜 璽

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

鉛是重金屬“五毒”之一，它不僅阻礙植物生長發(fā)育，降低作物產(chǎn)量和質(zhì)量，還可通過食物鏈的富集，被吸收到人體并嚴(yán)重危害人體健康[1]。NO是生物體中氧化還原信號分子和毒性分子，也是一種活性氮(RNS)。在植物體內(nèi)通過一氧化氮合酶(NOS)和硝酸還原酶(NR)催化形成[2]。研究表明，鉛對植物種子萌發(fā)及幼苗生長的影響通過其改變植物生理生化過程實(shí)現(xiàn)。魏學(xué)玲等[3]利用室內(nèi)水培試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，外源NO促進(jìn)Pb2+脅迫下小麥種子萌發(fā)及幼苗生長，增強(qiáng)小麥對Pb2+脅迫的適應(yīng)性，并能有效地緩解Pb2+脅迫下葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量的降低。張遠(yuǎn)兵等[4]發(fā)現(xiàn)，外源NO對Pb2+1 000 mg/L脅迫下高羊茅生長影響具有劑量效應(yīng)，適宜濃度能緩解鉛毒害，提高耐鉛性。孫立榮等[5]研究發(fā)現(xiàn)，50～100 μmol/L的外源NO供體硝普鈉(SNP)可以促進(jìn)鹽脅迫下黑麥草幼苗的生長，且100 μmol/L SNP促進(jìn)效果最明顯。雍山玉等[6]發(fā)現(xiàn)NO對植物體的作用具有雙重性，低濃度(100和300 μmol/L)SNP浸種處理能顯著緩解NaCl脅迫，抑制辣椒種子的萌發(fā)。

苜蓿為優(yōu)質(zhì)豆科牧草，具有產(chǎn)量高、持久性好、飼用價(jià)值高、用途廣等眾多優(yōu)點(diǎn)，在世界各地的畜牧業(yè)中發(fā)揮著重要的作用。苜蓿除了用于飼養(yǎng)牲畜之外，還可以作為護(hù)坡植物，園林上多用作鹽堿地、貧瘠土地的綠化草種和景觀野花用草種，同時(shí)也是很有利用價(jià)值的土壤鉛污染修復(fù)植物。為此，研究外源NO供體SNP結(jié)合Pb2+處理對雜花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生理生化特性的影響，以期通過調(diào)節(jié)NO水平來改善植物生理狀況，為深入研究農(nóng)作物Pb2+毒害的緩解技術(shù)提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 供試苜蓿品種為雜花苜蓿阿爾岡金，種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。發(fā)芽試驗(yàn)于2012年5～6月在培養(yǎng)室進(jìn)行。雜花苜蓿種子用蒸餾水反復(fù)沖洗然后吸干，于25 ℃下，設(shè)置6個(gè)處理，分別為CK完全Hoagland營養(yǎng)液；T1 Hoagland營養(yǎng)液+100 μmol/L SNP；T2 Hoagland營養(yǎng)液+250 mg/L氯化鉛；T3 Hoagland營養(yǎng)液+500 mg/L氯化鉛；T4 Hoagland營養(yǎng)液+100 μmol/L SNP+250 mg/L氯化鉛；T5 Hoagland營養(yǎng)液+100 μmol/L SNP+500 mg/L 氯化鉛，先浸種24 h，再于28 ℃催芽24 h后，選發(fā)芽一致的種子，播于放有濕潤濾紙10 cm的培養(yǎng)皿中，每蒸發(fā)皿100粒，置25 ℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，每天光照12 h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，定時(shí)取樣分析測定，每組重復(fù)7次。

1.1.2 幼苗培養(yǎng) 試驗(yàn)選用清洗干凈的細(xì)沙，用去離子水反復(fù)沖洗后烘干備用。選發(fā)芽一致的種子，播于裝有280 g干燥細(xì)沙的塑料杯內(nèi)。待幼苗長出真葉時(shí)，選長勢良好且一致的幼苗轉(zhuǎn)移到含Hoagland營養(yǎng)液的培養(yǎng)缽中繼續(xù)培養(yǎng)至三葉期時(shí)，設(shè)置6個(gè)處理，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，重復(fù)4次。各處理繼續(xù)培養(yǎng)20 d后，沖洗干凈葉片，用濾紙吸干多余水分，封入密封袋并迅速放入液氮中速凍，貯存于-80 ℃超低溫冰箱，用于各生理指標(biāo)的測定。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽、胚根的測定 發(fā)芽期間每隔24 h記錄1次，第4 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢、第10 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，胚根長和胚芽長采用精度0.1 mm游標(biāo)卡尺測量，每處理隨機(jī)抽取20株幼苗，分別測定，求平均數(shù)。

1.2.2 生理指標(biāo)的測定 植株根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定，游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑光化還原法測定，過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定[7]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003處理數(shù)據(jù)和繪圖，SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP對Pb脅迫下雜花苜蓿種子萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)是作物對外界有所反應(yīng)的開始，也是作物對外界反應(yīng)的敏感期。T1處理100 μmol/L SNP、T2處理250 mg/L氯化鉛(低Pb2+濃度)、T4處理100 μmol/L SNP+250 mg/L 氯化鉛(SNP與低Pb2+濃度組合)均提高了苜蓿種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和胚根胚芽長(表1)，與對照相比，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚根長、胚芽長依次提高6.49%，10.17%和22.03%，3.11%，10.17%和2.28%，4.93%，2.35%和22.77%，4.84%，17.44%和20.90%；T3處理500 mg/L氯化鉛(高Pb2+濃度)明顯降低了苜蓿種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚根長(P<0.05)，與CK相比，分別降低了9.04%，6.57%和11.74%；T5處理100 μmol/L SNP+500 mg/L氯化鉛(SNP與高 Pb2+濃度組合)處理明顯緩解了高鉛脅迫對種子發(fā)芽勢、胚根長的抑制作用，分別較T3處理增加了9.32%和11.17%(P<0.05)。

表1 SNP對Pb脅迫下雜花苜蓿種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of nitric oxide on seed germination under Pb stress

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 SNP對Pb脅迫下雜花苜蓿脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

各處理脯氨酸含量均顯著高于對照(P<0.05)(圖1)，分別較對照增加了49.19%、55.37%、128.62%、207.66%和57.28%。T4和T3處理可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于對照(P<0.05)，分別較對照增加3.84%和2.14%，其他處理與對照差異均不顯著。

2.3 SNP對Pb脅迫下雜花苜蓿可溶性糖和根系活力的影響

由圖2可知，T1，T4和T5處理的可溶性糖含量增幅顯著(P<0.05)；T2和T3處理可溶性糖含量降幅顯著(P<0.05)，分別下降了26.81%和21.06%。T1和T2處理的根系活力均顯著高于對照(P<0.05)，分別較對照增加13.28%和21.30%，其他處理均顯著低于對照(P<0.05)。

2.4 SNP對Pb脅迫下苜蓿MDA含量的影響

由圖3可知，T3，T4和T5處理的MDA含量均顯著大于對照(P<0.05)，分別是對照的2.26,1.55和2.13倍；T2顯著小于對照(P<0.05)，比對照小23.33%；T1處理與對照差異不明顯。

圖1 SNP對Pb脅迫下雜花苜蓿脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effects of NO on proline and protein contents under Pb stress

圖2 SNP對Pb脅迫下苜?？扇苄蕴呛透祷盍Φ挠绊慒ig.2 Effects of NO on water soluble sugar content and root activity under Pb stress

圖3 SNP對Pb脅迫下雜花苜蓿MDA含量的影響Fig.3 Effects of NO on MDA content under Pb stress

3 討論與結(jié)論

Pb2+是一種對植物生長發(fā)育有毒害的重金屬元素。種子能否正常萌發(fā)是某物種在某一地區(qū)形成自然群落的關(guān)鍵因素[8]。研究種子萌發(fā)對逆境脅迫的反應(yīng)，是系統(tǒng)認(rèn)識逆境傷害機(jī)理的較好途徑。NO作為一種信號分子能促進(jìn)種子萌發(fā)、提高種子的發(fā)芽率、促進(jìn)胚芽和胚根生長[9]。在試驗(yàn)中，T1(SNP)、T2(低Pb2+濃度)和T4(SNP與低Pb2+濃度組合)處理下，苜蓿種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽胚根長均高于相應(yīng)對照，說明NO、低鉛濃度、NO與低鉛濃度組合脅迫均對苜蓿種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用。

研究表明，Pb2+進(jìn)入植物體內(nèi)后絕大部分累積在根部[10]，其原因是Pb2+在根系主要以Pb(PO4)2和PbCO3等沉淀形式存在，在植物汁液中也有離子態(tài)和絡(luò)合態(tài)Pb，由于吸持、鈍化或沉淀作用，植物根系所吸收的Pb向地上部運(yùn)輸較困難，根系活力是反映其生長狀況的重要指標(biāo)。脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物與植物體內(nèi)活性氧自由基的清除以及膜脂過氧化作用的減弱有密切的關(guān)系[11]。植物在逆境條件下通過積累可溶性糖等有機(jī)物來調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，以增加適應(yīng)環(huán)境的能力[12]。可溶性蛋白含量升高有助于提高植物對逆境的抵抗力[13，14]。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的變化可作為檢測逆境條件下膜系統(tǒng)受傷害程度的指標(biāo)[15，16]。試驗(yàn)表明，與對照比較，T2處理下的雜花苜蓿幼苗，其MDA含量顯著下降，表明雜花苜蓿幼苗對鉛具有一定的耐性，低濃度促進(jìn)其生長，這與王艷等[17]在剪股穎、白彥真等[18]在紫花苜蓿上的研究結(jié)果一致；用T1處理雜花苜蓿幼苗，其MDA含量與對照差異不顯著，但小于對照，表明外源NO供體SNP可促進(jìn)雜花苜蓿幼苗的生長，這與前人在水稻[19]、向日葵[20]、白羽扇豆幼苗[21]、辣椒[6]和黑麥草[22]的研究結(jié)果相似，說明NO是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，能夠像生長素一樣調(diào)控植物生長；用T3(高Pb2+濃度)和T5(SNP與高Pb2+濃度組合)處理雜花苜縮幼苗，其MDA含量顯著增加，表明高濃度鉛脅迫下苜蓿幼苗膜脂過氧化水平提高，膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性下降；用T4處理雜花苜蓿幼苗，MDA含量雖高于對照，但顯著小于T3和T5處理，表明植株體內(nèi)的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)已經(jīng)啟動，提高了植株清除自由基防御系統(tǒng)的防御能力，緩解了高鉛脅迫對苜蓿幼苗的氧化損傷作用，使細(xì)胞膜受活性氧的傷害減輕。

綜上所述，低Pb2+濃度(250 mg/L )、SNP(100 μmol/L)、SNP與低Pb2+濃度(100 μmol/L SNP+250 mg/L)組合處理均增加了雜花苜蓿種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽胚根長，提高了幼苗脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白質(zhì)的含量，增強(qiáng)了根系活力，降低了MDA含量；高Pb2+濃度(500 mg/L)抑制了雜花苜蓿種子萌發(fā)和幼苗的生長，且100 μmol/L SNP不能緩解高鉛脅迫對植株的影響。

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