錢雪芬 張健鋒 俞智華 鞠少卿 毛振彪#

南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科1(226000) 外科綜合實(shí)驗(yàn)室2

胃癌是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤，在全球男女性癌癥死因中分居第三和第五位，研究胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，提高胃癌患者的早期診斷率和生存率已成為目前臨床研究工作的重點(diǎn)。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮細(xì)胞失去上皮特征、同時(shí)獲得間質(zhì)特征的過(guò)程，這一過(guò)程與上皮性惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-4]。尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(caudal-type homeobox transcription factor 2, CDX2)是一種腸特異性核轉(zhuǎn)錄因子，在維持正常腸上皮細(xì)胞分化和增殖調(diào)控中起重要作用。研究[5-7]發(fā)現(xiàn)CDX2過(guò)表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并降低其遷移、侵襲能力，提示CDX2基因在胃癌中起抑癌基因作用。CDX2抑制胃癌的作用是否與影響EMT有關(guān)，目前尚不清楚。本研究旨在探討CDX2對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響與EMT的關(guān)系，為揭示胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、MKN-45、AGS購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。pGPU6/GFP/Neo-CDX2-shRNA質(zhì)粒和無(wú)關(guān)序列(陰性對(duì)照)shRNA質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建，pEGFP-N1-CDX2真核表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒由南通大學(xué)附屬醫(yī)院外科綜合實(shí)驗(yàn)室提供。Lipofect-amine?2000 轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol?試劑、RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche Applied Science)，Transwell小室(EMD Millipore)，兔抗人上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)多克隆抗體(Proteintech Group, Inc.)。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：3株人胃癌細(xì)胞使用含10% FBS和100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前24 h于6孔板中每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，加入2 mL無(wú)抗完全培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，分別以250 μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋4.0 μg質(zhì)粒DNA和10 μL Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置5 min。混合兩種稀釋液，室溫靜置20～30 min，加入至6孔板中，補(bǔ)充無(wú)血清培養(yǎng)基至每孔2 mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后4～6 h更換無(wú)抗完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞或各組轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，以TRIzol?試劑提取總RNA，以RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20 ℃保存，待行qRT-PCR。Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)CDX2和內(nèi)參照β-actin的qRT-PCR引物。CDX2引物序列：F 5’-CGC CGC AGA ACT TCG TCA G-3’，R 5’-CGT AGC CAT TCC AGT CCT CCC-3’；β-actin引物序列：F 5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，R 5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’。qRT-PCR反應(yīng)體系內(nèi)含F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(Rox)10 μL、cDNA 3 μL、上、下游引物各0.6 μL(10 μmol/L)，以RNase-free H2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法計(jì)算CDX2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

4.劃痕試驗(yàn)：取各組轉(zhuǎn)染后24 h細(xì)胞，于6孔板中每孔接種5×105個(gè)，無(wú)抗完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，以無(wú)菌200 μL槍頭在單細(xì)胞層上劃痕，PBS洗去脫壁細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于劃痕后不同時(shí)間點(diǎn)在倒置顯微鏡下每孔選取4個(gè)視野拍照，記錄劃痕修復(fù)情況。劃痕修復(fù)率=(0 h劃痕寬度-某時(shí)點(diǎn)劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

5. 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：于Transwell小室上室面涂布30 μL Matrigel基底膜基質(zhì)膠，37 ℃放置1 h。取各組轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，以1×105/孔接種于Transwell小室上室中(100 μL)，下室中加入含20% FBS的培養(yǎng)基600 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS清洗，以棉簽輕輕拭去上室濾膜內(nèi)側(cè)面貼壁細(xì)胞， 4%多聚甲醛溶液固定濾膜10 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS清洗，待上室自然風(fēng)干，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)濾膜背面侵襲細(xì)胞，每張濾膜隨機(jī)計(jì)數(shù)中央部分和周圍部分共10個(gè)低倍視野(×100)，結(jié)果取均值。

6. 蛋白質(zhì)印跡法：取各組轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞提取總蛋白，測(cè)定蛋白含量，-80 ℃保存。SDS-PAGE凝膠電泳：上樣，恒壓調(diào)節(jié)80 V 30 min后120 V電泳60 min，恒流轉(zhuǎn)膜至PVDF膜300 mA 120 min，5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉2 h，將經(jīng)封閉液稀釋的一抗(兔抗人E-cadherin、vimentin多克隆抗體)稀釋液平鋪在封閉后的PVDF膜上，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，洗膜，ECL顯影，圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、胃癌細(xì)胞CDX2 mRNA表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)顯示，AGS細(xì)胞中CDX2 mRNA高表達(dá)，SGC-7901和MKN-45細(xì)胞中CDX2 mRNA低表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量分別為365.369±78.160、1.000±0.143和7.713±1.517(AGS對(duì)SGC-7901和MKN-45，P均<0.05)。

二、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

予CDX2低表達(dá)的MKN-45細(xì)胞轉(zhuǎn)染CDX2真核表達(dá)質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒，予CDX2高表達(dá)的AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染CDX2-shRNA或陰性對(duì)照shRNA，轉(zhuǎn)染后48 h以qRT-PCR檢測(cè)CDX2 mRNA表達(dá)以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒相比，MKN-45細(xì)胞轉(zhuǎn)染CDX2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-CDX2后，細(xì)胞中的CDX2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增高(3 064.000±278.160對(duì)1.000±0.143和7.253±1.517，P均<0.05)；與未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照shRNA相比，AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染CDX2干擾質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-CDX2-shRNA后，細(xì)胞中的CDX2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(1.000±0.240對(duì)11.567±1.460 和12.579±0.980，P均<0.05)。

三、胃癌細(xì)胞遷移能力

劃痕試驗(yàn)顯示，與同時(shí)點(diǎn)未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒相比，過(guò)表達(dá)CDX2的MKN-45細(xì)胞48 h和72 h時(shí)劃痕修復(fù)率明顯降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明細(xì)胞遷移能力降低；與同時(shí)點(diǎn)未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照shRNA相比，沉默CDX2表達(dá)的AGS細(xì)胞12 h、24 h和36 h時(shí)劃痕修復(fù)率均明顯增高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的MKN-45細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照shRNA的AGS細(xì)胞與相應(yīng)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，各時(shí)點(diǎn)劃痕修復(fù)率均無(wú)明顯差異(圖1)。

四、胃癌細(xì)胞侵襲能力

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，與未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒相比，過(guò)表達(dá)CDX2的MKN-45細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少，表明細(xì)胞侵襲能力降低；與未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照shRNA相比，沉默CDX2表達(dá)的AGS細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增多， 表明細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的MKN-45細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照shRNA的AGS細(xì)胞與相應(yīng)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，穿膜細(xì)胞數(shù)均無(wú)明顯差異(圖2)。

EV：空質(zhì)粒(empty vector)；NC：陰性對(duì)照(negative control)

五、胃癌細(xì)胞EMT標(biāo)記物表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒相比，過(guò)表達(dá)CDX2的MKN-45細(xì)胞中上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)顯著增高，間質(zhì)標(biāo)記物vimentin表達(dá)顯著降低，表明胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT逆轉(zhuǎn)；與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照shRNA相比，沉默CDX2表達(dá)的AGS細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)顯著降低，vimentin表達(dá)顯著增高，表明胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT(圖3)。

討 論

EMT是上皮細(xì)胞在特定條件下失去極性，向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)育中的一個(gè)基本過(guò)程[3-4]，可使在特定部位產(chǎn)生的上皮細(xì)胞從上皮組織中分離并遷移至其他位置，是正常發(fā)育、傷口愈合、組織重建等的基礎(chǔ)。目前，大量研究證實(shí)EMT參與了惡性腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展， 是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要過(guò)程[1-4]，EMT概念的提出使人們對(duì)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制有了更深刻的理解。EMT發(fā)生過(guò)程復(fù)雜，包括細(xì)胞間黏附力喪失、細(xì)胞外基質(zhì)破壞、細(xì)胞骨架重建等，涉及多個(gè)信號(hào)途徑和多種分子機(jī)制。在EMT過(guò)程中，上皮標(biāo)記物E-cadherin等表達(dá)降低，而間質(zhì)標(biāo)記物vimentin、fibronectin等表達(dá)增高，因此本研究選擇檢測(cè)E-cadherin、vimentin表達(dá)水平以反映胃癌細(xì)胞的EMT狀態(tài)。

A、B：各組穿膜細(xì)胞(×100)；C、D：各組每低倍視野穿膜細(xì)胞數(shù)比較(*P<0.05)

A：各組EMT標(biāo)記物表達(dá)蛋白質(zhì)印跡法電泳圖；B：各組EMT標(biāo)記物相對(duì)表達(dá)量比較(*P<0.05)

核轉(zhuǎn)錄因子CDX2在腸道發(fā)育和分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)CDX2在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌基因功能，其表達(dá)下調(diào)或缺失可導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，在結(jié)腸腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用：結(jié)腸癌組織CDX2表達(dá)較臨近正常組織顯著降低；雜合子Apc+/Delta716腺瘤性息肉病小鼠如合并CDX2+/-，結(jié)腸息肉數(shù)量可增加約6倍[8]；經(jīng)致癌劑氧化偶氮甲烷處理的CDX2+/-小鼠發(fā)生遠(yuǎn)端結(jié)腸侵襲性腺癌，野生型小鼠則未見腫瘤發(fā)生，CDX2+/-小鼠結(jié)腸上皮對(duì)放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性亦低于野生型小鼠[9]。最近研究[10]證實(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)受體酪氨酸激酶信號(hào)通路異常激活，誘導(dǎo)CDX2表達(dá)下調(diào)并促進(jìn)EMT，導(dǎo)致結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移。

CDX2是一種腸上皮細(xì)胞特異性核轉(zhuǎn)錄因子，正常胃黏膜組織不表達(dá)CDX2，而腸化生、異型增生和胃癌組織中存在CDX2異位表達(dá)[11]。近年研究顯示CDX2在胃癌中亦發(fā)揮抑癌基因功能。體外實(shí)驗(yàn)和裸鼠原位移植瘤模型均證實(shí)過(guò)表達(dá)CDX2可明顯抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖[5-7]，體外實(shí)驗(yàn)中，恢復(fù)胃癌細(xì)胞的CDX2表達(dá)還可降低其遷移、侵襲能力[5]。本研究劃痕試驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，予CDX2基因低表達(dá)的人胃癌細(xì)胞株MKN-45過(guò)表達(dá)CDX2能顯著抑制其遷移、侵襲能力，而沉默CDX2基因高表達(dá)的人胃癌細(xì)胞株AGS中的CDX2表達(dá)后，其遷移、侵襲能力顯著增強(qiáng)，表明CDX2表達(dá)水平改變可影響胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，從而參與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)CDX2可上調(diào)MKN-45細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)，下調(diào)vimentin表達(dá)，而沉默CDX2表達(dá)的作用與之相反，由此推測(cè)CDX2可能參與了胃癌細(xì)胞EMT的調(diào)控，其表達(dá)缺失可促進(jìn)EMT，過(guò)表達(dá)時(shí)則能逆轉(zhuǎn)EMT，從而抑制胃癌細(xì)胞遷移、侵襲。但CDX2具體通過(guò)何種途徑調(diào)控EMT，進(jìn)而參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，目前尚無(wú)明確結(jié)論，其間的分子機(jī)制有待深入研究。CDX2與EMT關(guān)系的研究可能為胃癌的診斷、治療提供新的診斷標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。

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