黃 誠(chéng)，尹 紅

(吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000)

基于超聲波輔助法的杜仲籽蛋白提取工藝優(yōu)化*

黃 誠(chéng)，尹 紅

(吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000)

采用單因素和正交試驗(yàn)方法對(duì)超聲波輔助提取杜仲籽蛋白工藝進(jìn)行了優(yōu)化.先選取料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、浸提pH值等條件對(duì)杜仲籽蛋白的提取工藝進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，采用L9(34)正交試驗(yàn)確定本工藝最佳條件.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在超聲波輔助提取杜仲籽蛋白最佳工藝條件(料液比為1∶25，超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為50 ℃，浸提pH值為10.0)下，杜仲籽蛋白提取率為77.03%.

杜仲籽蛋白；超聲波輔助提?。徽辉囼?yàn)

杜仲(EucommiaulmoiclesOliv)樹(shù)高可達(dá)15～20 m[1]，是中國(guó)地質(zhì)史上第三紀(jì)冰川運(yùn)動(dòng)殘留下來(lái)的古生物樹(shù)種[2]，是中國(guó)特有的單科單屬植物，為中國(guó)特有的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種[3].杜仲主要分布在中國(guó)的湖南、湖北、陜西、四川、重慶、貴州等西部省市[4]，而湘西武陵山區(qū)野生杜仲資源豐富，且建有規(guī)?；亩胖偕唐飞a(chǎn)基地[5]，湖南西部地區(qū)曾有杜仲8/3×104hm2，現(xiàn)成片仍有4/3×104多hm2.研究表明：杜仲皮蛋白具有較強(qiáng)抗菌作用[6-8]，杜仲籽中亦富含蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)在細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理功能中起著重要的作用，是人體生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)基礎(chǔ)；血紅蛋白可以攜氧，肌纖蛋白能夠收縮，糖蛋白具有識(shí)別功能，抗體的免疫、載體的運(yùn)輸、酶的催化、激素的調(diào)節(jié)都需要蛋白質(zhì)；杜仲籽中蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)具有較高利用價(jià)值.

目前蛋白的提取有很多方法，如酶法、堿提酸沉法、微波法等[9].蛋白質(zhì)提取涉及到物理、化學(xué)、生物等方面知識(shí)，但基本原理不外乎2個(gè)方面：一是利用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的2個(gè)或幾個(gè)物相中；二是將混合物置于單一物相中，通過(guò)物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于同區(qū)域而達(dá)到分離目的.本文采用通過(guò)物理力場(chǎng)超聲波技術(shù)提取方法，免去了高溫對(duì)提取成分的影響的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，目前廣泛運(yùn)用于天然植物有效成分提取[10-13].本實(shí)驗(yàn)以杜仲籽為原料，采用超聲波法輔助提取杜仲籽粕蛋白，通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳工藝參數(shù)，以便為杜仲籽粕中蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)提取提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

KDN-2C型定氮儀(上海纖檢儀器有限公司)；HYP-Ⅱ型消化爐(上海精隆科學(xué)儀器有限公司)；FW200型微型粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司)；索氏抽提裝置；SB-3200YDTD超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；LXJ-IIB飛鴿牌離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；雷磁PHS-J4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；723可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技有限公司)；溫度計(jì)；HH-2恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；BGZ-146干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；FA2004電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司).

1.2材料與試劑

杜仲籽(購(gòu)自湘西吉首)，石油醚(60～90 ℃沸程)，無(wú)水碳酸鈉，鄰苯二甲酸氫鉀，磷酸，無(wú)水乙醇，小牛血清蛋白(生化試劑)，濃鹽酸，濃硫酸，無(wú)水硫酸銅，硼酸，氫氧化鈉，硫酸鉀，所有試劑均為分析純?cè)噭?

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程 杜仲籽→去殼→干燥→粉碎→除去油脂→凱氏定氮法測(cè)杜仲籽粕中蛋白質(zhì)含量→超聲波提取→離心分離→噴霧干燥→產(chǎn)品.稱(chēng)取一定量脫脂杜仲籽粉，加入適量的水浸泡,用20%氫氧化鈉溶液調(diào)至浸泡液pH值到10,電動(dòng)攪拌,用高速離心機(jī)分離，所得清液用1∶1鹽酸調(diào)至蛋白等電點(diǎn).離心后，采用噴霧干燥法，制得產(chǎn)品.

1.3.2 原料預(yù)處理 杜仲籽去殼放入干燥箱中干燥后粉碎，用索氏抽提裝置去除杜仲籽中的油脂，低溫烘干，待用.

1.3.3 單因素試驗(yàn) (1)料液比對(duì)杜仲籽粕蛋白提取率的影響.固定pH值為10.0，提取時(shí)間為40 min，溫度為40 ℃，分別設(shè)定料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，研究料液比提取杜仲籽粕蛋白的最佳值.(2)時(shí)間對(duì)杜仲籽粕蛋白提取率的影響.固定pH值為10.0，溫度為4 0℃，料液比為1∶30，分別設(shè)定超聲時(shí)間為10，15，20，25，30，35 min，研究提取杜仲籽粕蛋白提最佳時(shí)間.(3)溫度對(duì)杜仲籽粕蛋白提取率的影響.固定pH值為10.0，提取時(shí)間為30 min，料液比為1∶30，分別設(shè)定超聲溫度為25，30，35，40，45，50 ℃，研究提取杜仲籽粕蛋白提最佳溫度.(4)浸提pH值對(duì)杜仲籽粕蛋白提取率的影響.固定超聲溫度50 ℃，料液比1∶30，超聲時(shí)間30 min，分別設(shè)定pH值為8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0，研究提取杜仲籽粕蛋白最佳pH值.

1.3.4 正交試驗(yàn) 選用提取時(shí)間、料液比、浸提液pH值及提取溫度對(duì)本工藝進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳工藝參數(shù)，正交實(shí)驗(yàn)中，采用蛋白質(zhì)提取率作為本工藝條件評(píng)價(jià)指標(biāo)，用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行選擇(見(jiàn)表1)[14].

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 杜仲籽粕蛋白等電點(diǎn)測(cè)定 取20 g脫脂油粕粉碎之后，加200 mL水浸泡,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%氫氧化鈉調(diào)至pH值至10,攪拌,離心得到上清液.分別取上清液20 mL，加鹽酸調(diào)pH至3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，靜止4～5 h，離心分離，然后測(cè)定沉淀前后上清液中蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)沉淀率最高者所對(duì)應(yīng)的pH值為沉淀蛋白質(zhì)的最佳等電點(diǎn).

1.3.6 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法 蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用 凱氏定氮法GB5511-85.

1.3.7.樣品測(cè)定 (1)將離心后的杜仲籽粕蛋白溶液定容到100 mL，準(zhǔn)確移取溶液10 mL，采用凱氏定氮法，計(jì)算出蛋白質(zhì)含量.(2)蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算公式：

2 結(jié)果與分析

2.1蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用微量凱氏定氮法對(duì)杜仲籽粕中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行3次平行測(cè)定[15]，測(cè)得杜仲籽粕中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.49%.

2.2超聲波輔助提取杜仲籽粕蛋白的單因素試驗(yàn)

圖1 料液比對(duì)蛋白提取率的影響

(1) 料液比對(duì)蛋白提取率的影響.料液比對(duì)杜仲籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果如圖1所示.

圖2 不同超聲時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

由圖1可知，由于杜仲籽粕中含有一定量的膳食纖維，當(dāng)料液比較小時(shí)，其中的膳食纖維具有較強(qiáng)的吸水膨脹能力，使物料流動(dòng)性差，難以攪拌，蛋白質(zhì)提取率低.當(dāng)料液比增加到1∶20時(shí)，料液比增大時(shí)，超聲波的滲透作用增強(qiáng)，可直接作用內(nèi)部組織，故提取率增高；繼續(xù)增加料液比發(fā)現(xiàn)在料液比為1∶30時(shí)，提取率達(dá)到最大值；再繼續(xù)增加料液比，提取率反而會(huì)下降，這可能是因?yàn)榱弦罕冗^(guò)大，可能造成其他物質(zhì)更多地溶解出來(lái)，阻礙杜仲籽粕中蛋白質(zhì)溶解.因此，本工藝提取杜仲籽粕蛋白的最佳料液比為1∶30.

(2) 超聲時(shí)間對(duì)杜仲籽粕蛋白提取率的影響.不同超聲時(shí)間下杜仲籽粕的蛋白提取率，結(jié)果如圖2所示.

由圖2可知，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)隨著浸提時(shí)間增加蛋白質(zhì)提取率升高.在30 min時(shí)提取率最大，隨著時(shí)間的進(jìn)一步增加，蛋白質(zhì)的提取率不升反降.這是由于超聲波的滲透作用，使得溶出物增多，阻礙杜仲籽粕中蛋白質(zhì)溶解，所以本工藝提取杜仲籽粕蛋白的最佳超聲時(shí)間為30 min.

圖3 不同超聲溫度對(duì)蛋白提取率的影響

(3) 超聲溫度對(duì)杜仲籽粕蛋白提取率的影響.不同超聲溫度下杜仲籽粕蛋白的提取率，結(jié)果如圖3所示.

由圖3可知，溫度高低對(duì)杜仲籽粕蛋白質(zhì)溶解度有較大影響，隨著溫度升高，蛋白質(zhì)提取率增大.但由于蛋白質(zhì)在50～60 ℃易受熱變性，維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的次級(jí)鍵被破壞，引起天然構(gòu)象的解體，原來(lái)在分子內(nèi)部的一些疏水基團(tuán)被暴露到分子表面，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的相互結(jié)合而凝結(jié)沉淀，使蛋白質(zhì)提取率下降[17-18].蛋白質(zhì)變性影響產(chǎn)品的功能性，而且黏度增大，分離困難，浸提能耗也增加，故本工藝提取杜仲籽粕蛋白的最佳超聲溫度為50 ℃.

圖4 不同浸提pH值對(duì)杜仲籽粕蛋白提取率的影響

(4) 浸提pH值對(duì)杜仲籽粕蛋白提取率的影響.不同浸提pH值下杜仲籽粕蛋白的提取率，結(jié)果如圖4所示.

由圖4可知，在pH為8.5～10范圍下，蛋白質(zhì)提取率隨著pH值得增大而逐漸增加，在pH為10.0的時(shí)候蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大值，pH值在10.0以后隨著pH值的增大蛋白質(zhì)的提取率反而降低.pH值太高，提取液會(huì)較粘稠，呈深褐色，在酸沉?xí)r會(huì)消耗大量的酸，導(dǎo)致產(chǎn)品中鹽分增加，不利于后續(xù)分離工序的進(jìn)行，堿性太強(qiáng)還可引起脫氨、脫羧、肽鍵斷裂，引起胱賴(lài)反應(yīng)，將氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸净衔?因此，綜合上述因素考慮，本工藝提取桐粕蛋白質(zhì)適宜pH值為10.0.

(5) 杜仲籽粕蛋白等電點(diǎn)的確定.加酸至等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)是從提取液中分離蛋白的有效方法，它可以使提取液中蛋白最大程度地沉淀.故等電點(diǎn)的選擇是本工藝的關(guān)鍵工序.按上述等電點(diǎn)確定方法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)提取液pH值為4時(shí)，蛋白質(zhì)沉淀率最高，為69.7%；當(dāng)pH值為4.5時(shí)，蛋白質(zhì)沉淀率為69.2%,兩者相差甚微，由此可知，最佳沉淀pH值為4.0～4.5之間.進(jìn)一步試驗(yàn)篩選，選取其中間值4.2試驗(yàn)，蛋白沉淀率為70.2%，高于兩端點(diǎn)pH值蛋白沉淀率.故本工藝選取pH值為4.2為酸沉最佳pH值，即為蛋白質(zhì)沉淀最佳等電點(diǎn).

2.3正交試驗(yàn)及結(jié)果分析

以杜仲籽粕蛋白提取率為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果計(jì)算表

極差的大小表明因素對(duì)指標(biāo)的影響程度.極差大，因素對(duì)指標(biāo)的影響大，該因素為重要因素；極差小，因素對(duì)指標(biāo)的影響小，該因素為不重要因素，依據(jù)極差大小，影響提取的主要因素為超聲時(shí)間和pH值，料液比和超聲溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響稍小一些，影響杜仲籽粕蛋白提取率的主要因素主次順序?yàn)椋築>D>A>C，最佳工藝為A1B2C2D2.最優(yōu)提取條件：料液比1∶25，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度50 ℃，pH值10.0.在此工藝條件下，杜仲籽粕蛋白的提取率為77.03%.

3 結(jié)語(yǔ)

(1) 研究了影響杜仲籽粕蛋白提取率的料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、浸提pH值等因素的提取條件.結(jié)果表明：影響杜仲籽粕蛋白提取的主要因素是超聲波提取時(shí)間，其次是pH值，超聲溫度、料液比對(duì)杜仲籽粕蛋白提取率影響較小.

(2) 等電點(diǎn)法是提取植物蛋白的常用方法.由實(shí)驗(yàn)可知：桐粕桐粕蛋白沉淀的等電點(diǎn)為pH值為4.3，該等電點(diǎn)沉淀杜仲籽粕蛋白，其沉淀率可達(dá)70.2%.采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)，以蛋白提取率為指標(biāo)，確定該工藝最佳參數(shù)為：料液比為1∶25、pH 值為10.0、超聲時(shí)間為30 min、超聲溫度為50 ℃.在此條件下杜仲籽粕蛋白的提取率達(dá)77.03%.

(3) 充分開(kāi)發(fā)和利用這些杜仲籽粕資源，不但可解決湘西地區(qū)蛋白飼料不足的問(wèn)題，而且還能夠改善環(huán)境,變廢為寶.同時(shí)對(duì)于開(kāi)發(fā)利用山區(qū)資源及杜仲種植、加工業(yè),飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展將帶來(lái)極大的促進(jìn)作用.

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(責(zé)任編輯 易必武)

TechnicalConditionsforUltrasound-AssistedExtractionofProteinofEucommiaSeed

HUANG Cheng，YIN Hong

(Food Science Institute,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China)

The optimum conditions for the ultrasound-assisted extraction of Eucommia seed protein were studied by single factor and orthogonal test method.The solid-liquid ratio,ultrasonic time,ultrasonic temperature,extraction pH value were selected as single factor to study experimental conditions of Eucommia seed protein extraction process,and then optimum process conditions were determined by L9(34) orthogonal test.The experimental results showed that the optimum conditions for ultrasound-assisted extraction of Eucommia seed proteins were as follows:solid to liquid ratio was 1∶25,ultrasonic time 30 min,ultrasonic temperature at 50 ℃,extraction pH value of 10.0.Under this condition,extraction rate of Eucommia seed protein was 77.03%.

protein of eucommia seed；ultrasound-assisted extraction；orthogonal test

1007-2985(2013)06-0078-05

2013-09-03

湖南省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目(2012J3099)

黃 誠(chéng)(1963-)，男，湖南洞口人，吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)及利用研究.

TS224.4；TQ351

A

10.3969/j.issn.1007-2985.2013.06.018