徐飛

1、湖南省腦科醫(yī)院 湖南 長沙 410007

2、湖南省疾病預防控制中心 湖南 長沙 410005

3、慈利縣疾病預防控制中心 湖南 慈利 427200

免疫培養(yǎng)-凝集法快速檢出痢疾桿菌的試驗

徐飛1李劍2王鵬3

1、湖南省腦科醫(yī)院 湖南 長沙 410007

2、湖南省疾病預防控制中心 湖南 長沙 410005

3、慈利縣疾病預防控制中心 湖南 慈利 427200

目的：建立免疫培養(yǎng)-凝集法的快速檢出痢疾桿菌方法，為疫情流行病學調查處理和病人早期診斷治療提供病原學依據(jù)。方法將經(jīng)大腸桿菌吸附后的福氏和宋內氏混合抗血清加入GN增菌肉湯培養(yǎng)液中，混勻后滴加于玻片凹處，再將離心沉淀后的糞便樣品上清液接種于該培養(yǎng)液中，放入濕盒37℃培養(yǎng)4～6h，取出并肉眼觀察玻片凹處培養(yǎng)液中的凝集菌團，凡發(fā)現(xiàn)一個凝集菌團即為陽性。每份樣品以常規(guī)細菌培養(yǎng)法做平行試驗。吸取凝集菌團并以細菌培養(yǎng)法進行驗證試驗。結果共檢測111份菌痢和腹瀉病人糞便樣品，免疫培養(yǎng)-凝集法檢出陽性41份，檢出率為36.9%，與細菌培養(yǎng)法檢出陽性的符合率達89.2%，兩種檢測方法的一致性為優(yōu)(Kappa=0.763)。凝集菌團被證實為痢疾桿菌占82.9%。結論免疫培養(yǎng)-凝集法具有操作簡便、快速、特異性好和敏感性高的優(yōu)點，在疫情調查處理和病人的早期診斷治療中具有一定意義。

免疫培養(yǎng)-凝集法；細菌培養(yǎng)；痢疾桿菌

細菌性痢疾是常見多發(fā)傳染病，在聚集人群中常出現(xiàn)暴發(fā)和流行，因此快速檢出病原菌對控制疫情和早期診斷治療病人具有十分重要意義。本文采用免疫培養(yǎng)-凝集法，在實驗室研究的基礎上，檢測111份菌痢病人和非菌痢病人糞便樣品，現(xiàn)將方法和結果報告如下：

1 實驗材料

1.1 菌種：F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6型福氏痢疾桿菌和宋內型痢疾桿菌，來自湖南省疾病預防控制中心和慈利縣疾病預防控制中心檢驗室保存的菌株。

1.2 抗痢疾桿菌免疫血清的制備：按文獻[1]用家兔分別制得F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6型和宋內氏七個型的免疫血清。試管凝集效價F1-F6均為1：3200，宋內氏為1：6400。用4株大腸桿菌(正常人糞便中分離出)的混合菌液(>30億/ml)吸收2次，除去非特異性抗體，吸收后特異抗體效價為1:1200，實驗時用稀釋度為1:20。

1.3 GN增菌肉湯培養(yǎng)液、甘油緩沖鹽水保菌液和SS培養(yǎng)基按常規(guī)法配制。

1.4 糞便標本：來自慈利縣疾病預防控制中心、慈利縣中醫(yī)院門診和住院病人，取糞便約1g，保存在甘油緩沖鹽水保菌液中。

2 實驗方法

2.1 糞便標本處理：已加入糞便的甘油緩沖鹽水保菌液，混合后1000rpm離心10分鐘，上清液作檢驗樣品。

2.2 被吸收后的抗血清用GN增菌肉湯1:20稀釋，取2滴加于載玻片兩端的凹窩，取被檢樣品上清液1接種環(huán)于左側混勻，再從中取一環(huán)于右側混勻，置塘瓷溫盒中37℃培養(yǎng)4～6小時后，取出肉眼觀察結果，有1個以上灰白色絮狀圓形凝集菌團為陽性，無凝集菌團為陰性。

2.3 病人糞便樣品同時以常規(guī)細菌培養(yǎng)法作平行試驗，以F2a和宋內氏菌株作陽性對照，并設陰性對照。

2.4 用微量注射器吸取凝集菌團，放入SS平皿中，用接種環(huán)劃線，37℃培養(yǎng)18～24小時后，按常規(guī)法分離鑒定。

3 實驗結果

3.1 免疫培養(yǎng)-凝集法和細菌培養(yǎng)法同時檢測111份菌痢病人和腹瀉病人糞便樣品，免疫培養(yǎng)-凝集法的檢出率為36.9%，與常規(guī)細菌培養(yǎng)法的檢出率33.3%沒有差別(P=0.388)，結果見表1。

3.2 兩種檢測方法一致的檢出率為29.7%，以細菌培養(yǎng)法陽性樣本為參考，兩種檢測方法檢出符合率達89.2%。兩種檢測方法一致性為優(yōu)(Kappa=0.763, P<0.001)，結果見表1。

表1 免疫培養(yǎng)-凝集法與細菌培養(yǎng)法檢出痢疾桿菌結果

3.3 對41份免疫培養(yǎng)-凝集法陽性樣品的凝集菌團進行純培養(yǎng)鑒定，有34份被證實為痢疾桿菌占82.9%，其菌型與細菌培養(yǎng)一致，結果表明免疫培養(yǎng)-凝集法的檢出結果是可靠的。

4 討論

免疫培養(yǎng)-凝集法是將傳統(tǒng)的細菌增菌培養(yǎng)與抗血清的凝集反應進行有機的結合，使痢疾桿菌在含有相應抗血清的液體培養(yǎng)基中生長的同時又不斷的與相應抗體結合，進而成凝集性生長繁殖，可形成直徑在100μm左右的灰白色特異性凝集菌團[2]，肉眼很容易觀察到，從而使該方法具有操作簡便、快速、特異性好、敏感性高的優(yōu)點。

有4份常規(guī)細菌培養(yǎng)法陽性的樣品，而免疫培養(yǎng)-凝集法則為陰性。這表明該方法存在病例診斷時的漏診現(xiàn)象。造成的原因，一是這4份樣品中有1份細菌培養(yǎng)法檢出為痢疾志賀氏菌，不屬免疫培養(yǎng)-凝集法使用的混合特異性抗血清檢測范圍所致。二是另有2份樣品常規(guī)細菌培養(yǎng)法檢出為未定型株，說明痢疾桿菌的抗原性變異亦是該方法漏診的原因之一[3]。這方面有待進一步研究。

該方法使用的抗血清需經(jīng)腸道菌吸附，以除去其它腸道菌的非特異性抗原[1]，另外GN增菌肉湯培養(yǎng)液，既有增菌培養(yǎng)作用，又有抑制糞便中其它腸道菌生長的使用[4]，以及接種時取經(jīng)離心沉淀處理的上清液糞便樣品，這些都是減少非特異反應的措施。

免疫培養(yǎng)-凝集法與細菌培養(yǎng)法具有很好的檢出一致性，檢出陽性時間只需4～6小時，克服了常規(guī)細菌培養(yǎng)法時間長的缺點，具有快速檢出特點，對疫情的處理和病人的診斷治療都有重要意義。

[1]上海市衛(wèi)生防疫站．衛(wèi)生防疫檢驗：細菌檢驗[M]．上?？茖W技術出版社，1979，23-35．

[2]魯開國，陶秀蓮，生菊，等．免疫微菌落染色法快速診斷霍亂弧菌研究[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志，1994，4：202-204．

[3]張卓然，倪語星．臨床微生物學和微生物檢驗[M]．3版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：119．

[4] 胡小玲，沈永芳．沙門-志賀菌增菌培養(yǎng)基的研究[J]．實用預防醫(yī)學，2006，13(4)：1025-1026．

R446.13

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1009-6019(2014)08-0248-01