張海鴿

6MV-X線對人食管癌細胞系EC-9706Bcl-2基因表達的影響

張海鴿

目的 研究X線對人食管癌細胞系EC-9706 B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)基因表達的影響。方法 采用RT-PCR法測人食管癌細胞系EC-9706經(jīng)0、4、6 Gy的X線照射后1、6、24 h Bcl-2基因表達的變化。結(jié)果 X線照射可以顯著降低人食管癌細胞株EC-9706Bcl-2基因的表達。結(jié)論 X線照射人食管癌細胞系EC-9706細胞后Bcl-2基因的表達在0～6 Gy無劑量依賴性, 在不同的時間點上Bcl-2的表達穩(wěn)定。

人食管癌細胞系；Bcl-2；RT-PCR

食管癌是一種常見的消化道惡性腫瘤, 放療是主要的治療方法之一。放療的主要機制是誘導細胞凋亡。Bcl-2是目前發(fā)現(xiàn)的抗凋亡作用最強的基因之一, Bcl-2的高表達可以抑制正常細胞或腫瘤細胞的凋亡。本文采用RT-PCR法檢測X線作用后Bcl-2基因表達的變化, 進而探討該基因與食管癌放療敏感性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI-1640培養(yǎng)液, 標準胎牛血清、胰蛋白酶、TRIzolR Reagent、PCR反應試劑盒、PCR引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、GAPDH基因、Bcl-2基因、培養(yǎng)皿35 mm×10 mm。儀器設備：水套式CO2培養(yǎng)箱、置顯微鏡、紫外分光光度計、實時定量PCR儀、臺式高速離心機、低溫離心機、PE管、PCR反應管。人食管癌細胞系EC-9706購自中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室。

1.2 方法

1.2.1 將細胞培養(yǎng)至對數(shù)期, 制備單細胞懸液, 以2×106個細胞分別接27個培養(yǎng)皿中, 注意盡量使細胞分散均勻, 將27個培養(yǎng)皿置入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后分成三組。以酒精消毒醫(yī)用直線加速器治療床, 鋪雙層濕毛巾補償厚度使總厚度達到1.5 cm, 培養(yǎng)皿置于其上, 以0、4、6 Gy的6MV-X線分別照射, 照射時培養(yǎng)皿置于照射野邊緣2 cm以內(nèi), 機頭旋轉(zhuǎn)180°,射線從下方入射, 劑量率2 Gy/min。SSD(源皮距)為 100 cm, 射野大小為22 cm×15 cm。照射后立即送回實驗室,更換培養(yǎng)液, 在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。在照射后1 h時, 每劑量組各取3皿, 制備成單細胞懸液, 用吸管移至無菌離心管,以1000 rpm轉(zhuǎn)速離心5 min, 懸浮細胞沉淀后棄去上清, 再用PBS清洗1次, 再次離心并棄去上清, 放入-80℃冰箱保存。至6、24 h時重復上述操作。

1.2.2 用TRIZOL試劑提取所收集細胞的總RNA(按操作說明進行),紫外分光光度計測定所提取樣本在波長260 nm和在波長280 nm處的吸光度(OD260和OD280),計算RNA的純度和濃度,確保RNA的純度在1.9～2.0。以瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性, 各樣本均出現(xiàn)三條清晰條帶且無彌散, 從上至下分別是5、18和28srRNA, 且經(jīng)分析28srRNA的亮度約是18srRNA的1.5～2.0倍, 說明所提取的總RNA完整性好,無RNA酶的降解。將所提取的樣本總RNA置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物的設計與合成 Bcl-2和GAPDH上下游引物參照文獻, Bcl-2［1］上游：CTGGTGGGAGCTTGCATCAC下游：ACAG CCTGCAGCTTTGTTTC GAPDH［2］；上游：TGGGCTACACTGAGCA CCAG, 下游：CAGCGTCAAAGGTGG AGGAG。

1.2.4 cDNA的合成 利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ExScriptTM RT-reagent Kit)將提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄, 在反應體系為10 μl的逆轉(zhuǎn)錄反應管中加入組分, 見表1。

表1 10 μl RNA反轉(zhuǎn)錄體系

反應條件：1.37℃ 15 min；2.85℃ 5sec；按反應條件操作, 即可得到cDNA, -20℃保存。

1.2.5 Real-Time 熒光定量PCR反應 以逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板, 進行實時熒光定量PCR擴增。Bcl-2為目的基因, 內(nèi)參基因為GAPDH, 本實驗采用TaKaRa Real-Time Quantitative PCR試劑盒進行。在冰上進行PCR反應液的配制。反應條件嚴格遵照試劑盒說明書。在PCR反應管內(nèi)加入組分,見表2。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS11.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差( x-±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

照射后, 同一時間點上4 Gy組和6 Gy組與對照組(0 Gy)比較, Bcl-2基因的表達隨劑量的增加而減少, 并且下降急劇。將對照組分別與4、6 Gy組進行比較, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。4 Gy組與6 Gy組進行對比提示差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05), 說明照射劑量增加并未影響B(tài)cl-2的表達。見表3。

表2 20 μl PCR反應體系

表3 照射后Bcl-2基因表達相對量( x-±s)

3 討論

Bcl-2是迄今研究最深入、最廣泛的凋亡調(diào)控基因之一。細胞凋亡受凋亡相關(guān)基因調(diào)控, 在肺癌、前列腺癌、乳腺癌以及結(jié)腸癌等實體瘤的細胞中發(fā)現(xiàn)Bcl-2的異常表達使腫瘤細胞存活時間延長, 同時還抑制化療藥物、放射線、癌基因等多種因素介導的細胞凋亡, 使治療變得困難。通過上述實驗提示食管癌也高表達Bcl-2蛋白, 因此研究Bcl-2基因?qū)τ谑彻馨┑姆呕熂熬C合治療具有一定的臨床意義。

張維珍等［3］的研究結(jié)果顯示Bcl-2的表達與放療療效呈負相關(guān), 提示Bcl-2陽性表達尤其是高表達時應考慮調(diào)整放療方法和劑量。為了探討6MV-X線對食管癌細胞系EC-9706的殺傷機制, 作者對各分組EC-9706細胞內(nèi)Bcl-2的mRNA采用熒光定量RT-PCR技術(shù)進行了檢測。結(jié)果顯示, 4 Gy X線照射后1 h, Bcl-2基因的表達急劇下降, 與其他研究的結(jié)論相符, X射線可降低Bcl-2的表達。以＞4 Gy劑量照射后, Bcl-2的表達卻與4 Gy組基本相同, 而以＜4 Gy的劑量照射其表達的變化情況有待進一步研究。因為Bcl-2是凋亡抑制基因, 故而又被稱為細胞的“生死開關(guān)”, 作者認為放射線對食管癌細胞的殺滅, 與射線降低Bcl-2表達啟動了細胞凋亡程序有關(guān)。

［1］ Tsujimoto Y, Croce CM.Analysis of the structure,transcripts,and protein products of bcl-2, the gene involved in human follicular lymphoma.Proc Natl Acad Sci USA, 1986(83):5214-5218.

［2］ Hidetoshi T, Akira M, Akemi I, et al.Aberrant expression of apoptosis-related molecules in psoriatic epidermis.Journal of Dermatological Science, 2002(28):187-197.

［3］ 張維珍,張陽,孔天東,等.食管癌中C-erbB-2, bcl-2, mdr-1的表達與同步放化療療效及預后關(guān)系的研究.實用診斷與治療雜志, 2007, 21(12):921-923.

2014-08-11］

471000 鄭州大學附屬洛陽市中心醫(yī)院放療科