韓義勝　符策強　朱紅林等

摘要：以改良天豐B為低直鏈淀粉含量合成基因和白葉枯病抗性基因供體，以龍?zhí)仄諦為受體，利用分子標(biāo)記輔助選擇和常規(guī)不育系選育方法，對保持系龍?zhí)仄?B的直鏈淀粉和白葉枯病抗性進行了改良。 改良后的龍?zhí)仄諦保留了原有的大部分性狀，并具有直鏈淀粉含量低、抗白葉枯病、株高變矮的新特性。

關(guān)鍵詞：不育系；直鏈淀粉；白葉枯??；分子標(biāo)記輔助選擇；基因聚合；改良

中圖分類號： S336；S511.03 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0069-03

收稿日期：2014-03-10

基金項目：國家水稻產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-01-73）。

作者簡介：韓義勝（1974—），男，湖北宣恩人，碩士，助理研究員，從事水稻種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：hanys135@163.com。

通信作者：徐靖，女，碩士，助理研究員，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：xujing6732807@126.com。雜交水稻在我國水稻產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要的地位，其產(chǎn)量優(yōu)勢已被廣泛認(rèn)可；但是在產(chǎn)量繼續(xù)大幅度提高受到空間制約的情況下，水稻種植的效益問題逐漸引起人們的重視，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的復(fù)合型水稻品種取代單一產(chǎn)量優(yōu)勢的品種已成為必然趨勢。在沒有重大技術(shù)突破的情況下，現(xiàn)代雜交水稻育種很大程度上就是親本不斷聚合優(yōu)異性狀的改良型育種。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，水稻中許多優(yōu)異基因已被定位，這為利用分子標(biāo)記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）技術(shù)對作物遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。近年來，MAS技術(shù)在基因轉(zhuǎn)移或聚合上的應(yīng)用獲得了很大成功。如Huang等運用MAS技術(shù)分別將水稻白葉枯病抗性基因Xa-4、xa-5、xa-13和Xa-21聚合到同一水稻品種中，獲得高抗白葉枯病的品種[1]；陳紅旗等利用MAS技術(shù)將3個稻瘟病抗性基因聚合到金23B中，獲得高抗稻瘟病的品種[2]。利用MAS技術(shù)將多個抗病基因聚合以培育高抗病害材料的方法，具有經(jīng)濟高效的特點，但是將優(yōu)良品質(zhì)基因和抗性基因聚合到同一品種中的研究卻相對較少。

龍?zhí)仄諥（簡稱特A）是福建省漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的野敗型秈型三系不育系，具有配合力強、適應(yīng)性廣、易于繁殖種的優(yōu)點。特優(yōu)系列雜交稻組合在我國許多省份曾大面積應(yīng)用，僅1998 年全國推廣面積就達76.71 萬hm2，占雜交水稻總面積的512%[3]，但特A也有直鏈淀粉含量高、不抗白葉枯病等缺點，應(yīng)用受到很大限制。因此，改良特A很有必要，對不育系的改良實質(zhì)上就是對保持系的改良。本研究以改良天豐B（簡稱天豐B）為目標(biāo)基因供體，龍?zhí)仄諦（簡稱特B）為受體，利用雜交、MAS和常規(guī)不育系選育方法，對特B的米質(zhì)（主要是直鏈淀粉含量）和白葉枯病抗性進行了改良。改良后的特B保留了原有的穗大、粒多特性，同時具有直鏈淀粉含量低、抗白葉枯病、株高變矮的新特性，在風(fēng)雨天氣頻繁、白葉枯病多發(fā)的海南地區(qū)，新特B具有廣泛的應(yīng)用前景。

1材料與方法

1.1試驗材料

受體親本為特B，直鏈淀粉含量為26.5%，不抗白葉枯病。天豐B為低直鏈淀粉合成基因供體，直鏈淀粉含量為15.7%；攜帶廣譜性白葉枯病抗性基因Xa23，抗白葉枯病。供體由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供，試驗各世代材料均種植于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院永發(fā)基地，常規(guī)水肥和蟲害管理；接種用白葉枯Ⅳ病菌由海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所提供。

1.2目標(biāo)基因連鎖標(biāo)記

以與控制直鏈淀粉合成的Wx基因連鎖的SSR標(biāo)記RM190[4]和與Xa23基因連鎖的標(biāo)記RM206[5]為MAS標(biāo)記。標(biāo)記由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成，其他主要生物試劑由上海博彩生物科技有限公司合成。

1.3DNA提取和PCR擴增

DNA提取參照桑賢春等的方法[6]。20μL PCR反應(yīng)總體系為：2 μL正、反引物（5 μmol/L）；0.3 μL dNTP（10 mmol/L）；0.2 μL Taq酶（5 U/μL）；2 μL 10×PCR buffer[200 mmol KCl；200 mmol/L Tris-HCl，pH值8.3；100 mmol/L （NH4）2SO4；15 mmol/L MgCl2]；2 μL DNA模板；11.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。反應(yīng)完成后設(shè)15 ℃保護溫度。采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染按照施勇烽等的方法[7]進行。

1.4培育新特B的方法

以特B為母本、天豐B為父本進行雜交，特B為輪回親本?；亟粫r，利用MAS技術(shù)并結(jié)合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，選取RM190和RM206標(biāo)記雜合條帶的單株連續(xù)回交3代，至BC3F1時自交，在BC3F2群體中，選取2個標(biāo)記都為純合條帶的單株，以特A為母本，連續(xù)測保、加代。在回交轉(zhuǎn)育過程中，以保持不育性和理想株型為篩選條件，選擇株型緊湊、劍葉直立、株高較特B稍矮的單株為測保單株。最后通過對BC3F6各單株進行直鏈淀粉含量測定，以直鏈淀粉含量在15%～17%的單株為入選單株（圖1）。

1.5白葉枯病抗性和直鏈淀粉含量的測定

白葉枯病抗性鑒定采用人工剪葉接種法[8]；稻米直鏈淀粉測定參照GB/T 15683—2008《大米直鏈淀粉含量的測定》進行。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)記分析與選擇

RM190和RM206在供、受體親本間（P1和P2）的多態(tài)性良好，能精確區(qū)分雜合和純合基因型，適宜MAS育種。2個標(biāo)記在BC3F2群體均出現(xiàn)3種帶型（圖2）?；亟粫r，每次都選2個標(biāo)記均為雜合帶型的單株回交，至BC3F1，然后自交。在BC3F2群體中，首先用RM190檢測，將帶型為3的單株挑出，然后用RM206檢測，再次將帶型為3的單株挑出，此時挑出的單株已經(jīng)聚合低直鏈淀粉合成基因和Xa23基因，且處于純合狀態(tài)。從658個BC3F2單株中選擇25個農(nóng)藝性狀較好的單株用于回交轉(zhuǎn)育和加代。通過連續(xù)6次轉(zhuǎn)育、加代，并對轉(zhuǎn)育材料進行米質(zhì)檢測、白葉枯病抗性鑒定和農(nóng)藝性狀優(yōu)選，最終獲得了2個抗白葉枯病，株型與原特B相似但株高略矮、具有不同低直鏈淀粉的特B改良系，分別編號為D1、D2。

2.2白葉枯病抗性鑒定

采用海南白葉枯主要生理小種Ⅳ病菌接種2個特B改良系，進行白葉枯病抗性鑒定，在分蘗結(jié)束回水期接種，20 d后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2個特B改良系病斑長度≤1.2 cm的株數(shù)占總株數(shù)的90%，全部表現(xiàn)為高抗，與供體天豐B抗性相似，明顯強于原來的特B（表1）。

3結(jié)論與討論

3.1稻米品質(zhì)的改良

稻米品質(zhì)內(nèi)涵豐富，但直鏈淀粉一直被認(rèn)為是稻米品質(zhì)的核心指標(biāo)之一，對蒸煮和食味品質(zhì)指標(biāo)，如稻米的吸水性、脹性、黏性和軟硬度等有著決定性的影響[9]。低直鏈淀粉是優(yōu)質(zhì)稻米的重要指標(biāo)。稻米淀粉形成機理比較復(fù)雜，栽培條件和遺傳組成都對直鏈淀粉有較大影響[10-13]，從遺傳上改良稻米直鏈淀粉仍是育種專家的主要研究方向。多數(shù)研究認(rèn)為，直鏈淀粉由1對或2對主效基因控制，并受微效多基因的修飾。目前公認(rèn)蠟質(zhì)基因Wx是控制直鏈淀粉的主效基因[14]，因此尋找與Wx基因連鎖的分子標(biāo)記是MAS技術(shù)育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究利用RM190標(biāo)記進行分子標(biāo)記輔助選擇，對改良特B稻米直鏈淀粉檢測結(jié)果顯示，含量均在16%左右，與供體接近。由此可見，在選育直鏈淀粉梯度的育種材料時，可以用標(biāo)記RM190進行分子輔助選擇。

3.2水稻白葉枯病抗性改良

截至 2013 年，已報道的白葉枯病抗性基因已有38 個[15]，但不同抗性基因的抗病力和抗譜卻有較大差別。在目前已鑒定并定位的抗性基因中，Xa23具有抗性強、抗譜廣、抗性持久、表型顯性等特點[8]。本研究選擇已導(dǎo)入Xa23基因的天豐B作為改良特B白葉枯病抗性的供體。從獲得的2個改良系接種白葉枯Ⅳ病菌表現(xiàn)看，Xa23基因?qū)Ｄ习兹~枯病生理小種病菌具有較好的抗性。

3.3利用MAS技術(shù)聚合多個基因的改良型育種

對于表型鑒定困難或鑒定費時費力的一些性狀，MAS育種無需考慮環(huán)境條件對基因表達的影響，可以在苗期或低世代進行選擇。但是，MAS技術(shù)的準(zhǔn)確性依賴于目標(biāo)基因與連鎖標(biāo)記的緊密程度，連鎖越緊密，選擇結(jié)果越可靠。因此開發(fā)與目標(biāo)性狀（基因）緊密連鎖的分子標(biāo)記是進行MAS技術(shù)育種的前提條件。隨著水稻高密度遺傳圖譜的構(gòu)建和水稻全基因組測序的完成，分子標(biāo)記的開發(fā)越來越便捷高效，利用MAS技術(shù)進行有利基因的聚合育種必將成為現(xiàn)代育種的重要途徑，特別是抗性育種[3-4]，但是將抗性基因和優(yōu)良品質(zhì)基因通過MAS技術(shù)聚合在同一個品種中卻不多見。抗性好、質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高應(yīng)是篩選水稻良種的必然要求。本試驗將低直鏈淀粉合成基因和白葉枯病抗性基因聚合在特B中，檢測表明2個改良系的直鏈淀粉含量和白葉枯病抗性都達到了預(yù)期目標(biāo)。

參考文獻：

[1]Huang N，Angeles E R，Domingo J，et al. Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice：marker-assisted selection using RFLP and PCR[J]. Theoretical and Applied Genetics，1997，95（3）：313-320.

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[10]馬均，明東風(fēng)，馬文波，等. 不同施氮時期對水稻淀粉積累及淀粉合成相關(guān)酶類活性變化的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（2）：290-296.

[11]于新，趙慶勇，趙春芳，等. 攜帶Wx-mq基因的不同類型水稻新品種（系）直鏈淀粉含量分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，28（6）：1218-1222.

[12]石英堯，石揚娟，張志轉(zhuǎn)，等. 旱作對稻米直鏈淀粉含量的影響研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（17）：4253-4254.

[13]錢永德，鄭桂萍，李小蕾，等. 氮鎂耦合對粳稻龍粳20稻米外觀品質(zhì)和加工品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（7）：40-44.

[14]蔡秀玲，劉巧泉，湯述翥，等. 用于篩選直鏈淀粉含量為中等的秈稻品種的分子標(biāo)記[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2002，28（2）：137-144.

[15]國家水稻數(shù)據(jù)中心. 基因數(shù)據(jù)分類檢索[EB/OL]. （2013-07-15）[2013-09-04]. http：//www.ricedata.cn/gene/.

2.2白葉枯病抗性鑒定

采用海南白葉枯主要生理小種Ⅳ病菌接種2個特B改良系，進行白葉枯病抗性鑒定，在分蘗結(jié)束回水期接種，20 d后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2個特B改良系病斑長度≤1.2 cm的株數(shù)占總株數(shù)的90%，全部表現(xiàn)為高抗，與供體天豐B抗性相似，明顯強于原來的特B（表1）。

3結(jié)論與討論

3.1稻米品質(zhì)的改良

稻米品質(zhì)內(nèi)涵豐富，但直鏈淀粉一直被認(rèn)為是稻米品質(zhì)的核心指標(biāo)之一，對蒸煮和食味品質(zhì)指標(biāo)，如稻米的吸水性、脹性、黏性和軟硬度等有著決定性的影響[9]。低直鏈淀粉是優(yōu)質(zhì)稻米的重要指標(biāo)。稻米淀粉形成機理比較復(fù)雜，栽培條件和遺傳組成都對直鏈淀粉有較大影響[10-13]，從遺傳上改良稻米直鏈淀粉仍是育種專家的主要研究方向。多數(shù)研究認(rèn)為，直鏈淀粉由1對或2對主效基因控制，并受微效多基因的修飾。目前公認(rèn)蠟質(zhì)基因Wx是控制直鏈淀粉的主效基因[14]，因此尋找與Wx基因連鎖的分子標(biāo)記是MAS技術(shù)育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究利用RM190標(biāo)記進行分子標(biāo)記輔助選擇，對改良特B稻米直鏈淀粉檢測結(jié)果顯示，含量均在16%左右，與供體接近。由此可見，在選育直鏈淀粉梯度的育種材料時，可以用標(biāo)記RM190進行分子輔助選擇。

3.2水稻白葉枯病抗性改良

截至 2013 年，已報道的白葉枯病抗性基因已有38 個[15]，但不同抗性基因的抗病力和抗譜卻有較大差別。在目前已鑒定并定位的抗性基因中，Xa23具有抗性強、抗譜廣、抗性持久、表型顯性等特點[8]。本研究選擇已導(dǎo)入Xa23基因的天豐B作為改良特B白葉枯病抗性的供體。從獲得的2個改良系接種白葉枯Ⅳ病菌表現(xiàn)看，Xa23基因?qū)Ｄ习兹~枯病生理小種病菌具有較好的抗性。

3.3利用MAS技術(shù)聚合多個基因的改良型育種

對于表型鑒定困難或鑒定費時費力的一些性狀，MAS育種無需考慮環(huán)境條件對基因表達的影響，可以在苗期或低世代進行選擇。但是，MAS技術(shù)的準(zhǔn)確性依賴于目標(biāo)基因與連鎖標(biāo)記的緊密程度，連鎖越緊密，選擇結(jié)果越可靠。因此開發(fā)與目標(biāo)性狀（基因）緊密連鎖的分子標(biāo)記是進行MAS技術(shù)育種的前提條件。隨著水稻高密度遺傳圖譜的構(gòu)建和水稻全基因組測序的完成，分子標(biāo)記的開發(fā)越來越便捷高效，利用MAS技術(shù)進行有利基因的聚合育種必將成為現(xiàn)代育種的重要途徑，特別是抗性育種[3-4]，但是將抗性基因和優(yōu)良品質(zhì)基因通過MAS技術(shù)聚合在同一個品種中卻不多見?？剐院?、質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高應(yīng)是篩選水稻良種的必然要求。本試驗將低直鏈淀粉合成基因和白葉枯病抗性基因聚合在特B中，檢測表明2個改良系的直鏈淀粉含量和白葉枯病抗性都達到了預(yù)期目標(biāo)。

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[5]羅小芬，鄧椋爻，劉丕慶，等. 水稻抗白葉枯病Xa23基因的微衛(wèi)星標(biāo)記RM206在育種群體中的多態(tài)性分析[J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2007，26（2）：120-124.

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[9]夏明元，李進波，張建華，等. 利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)選育具有中等直鏈淀粉含量的早稻品種[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004（2）：183-186.

[10]馬均，明東風(fēng)，馬文波，等. 不同施氮時期對水稻淀粉積累及淀粉合成相關(guān)酶類活性變化的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（2）：290-296.

[11]于新，趙慶勇，趙春芳，等. 攜帶Wx-mq基因的不同類型水稻新品種（系）直鏈淀粉含量分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，28（6）：1218-1222.

[12]石英堯，石揚娟，張志轉(zhuǎn)，等. 旱作對稻米直鏈淀粉含量的影響研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（17）：4253-4254.

[13]錢永德，鄭桂萍，李小蕾，等. 氮鎂耦合對粳稻龍粳20稻米外觀品質(zhì)和加工品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（7）：40-44.

[14]蔡秀玲，劉巧泉，湯述翥，等. 用于篩選直鏈淀粉含量為中等的秈稻品種的分子標(biāo)記[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2002，28（2）：137-144.

[15]國家水稻數(shù)據(jù)中心. 基因數(shù)據(jù)分類檢索[EB/OL]. （2013-07-15）[2013-09-04]. http：//www.ricedata.cn/gene/.

2.2白葉枯病抗性鑒定

采用海南白葉枯主要生理小種Ⅳ病菌接種2個特B改良系，進行白葉枯病抗性鑒定，在分蘗結(jié)束回水期接種，20 d后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2個特B改良系病斑長度≤1.2 cm的株數(shù)占總株數(shù)的90%，全部表現(xiàn)為高抗，與供體天豐B抗性相似，明顯強于原來的特B（表1）。

3結(jié)論與討論

3.1稻米品質(zhì)的改良

稻米品質(zhì)內(nèi)涵豐富，但直鏈淀粉一直被認(rèn)為是稻米品質(zhì)的核心指標(biāo)之一，對蒸煮和食味品質(zhì)指標(biāo)，如稻米的吸水性、脹性、黏性和軟硬度等有著決定性的影響[9]。低直鏈淀粉是優(yōu)質(zhì)稻米的重要指標(biāo)。稻米淀粉形成機理比較復(fù)雜，栽培條件和遺傳組成都對直鏈淀粉有較大影響[10-13]，從遺傳上改良稻米直鏈淀粉仍是育種專家的主要研究方向。多數(shù)研究認(rèn)為，直鏈淀粉由1對或2對主效基因控制，并受微效多基因的修飾。目前公認(rèn)蠟質(zhì)基因Wx是控制直鏈淀粉的主效基因[14]，因此尋找與Wx基因連鎖的分子標(biāo)記是MAS技術(shù)育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究利用RM190標(biāo)記進行分子標(biāo)記輔助選擇，對改良特B稻米直鏈淀粉檢測結(jié)果顯示，含量均在16%左右，與供體接近。由此可見，在選育直鏈淀粉梯度的育種材料時，可以用標(biāo)記RM190進行分子輔助選擇。

3.2水稻白葉枯病抗性改良

截至 2013 年，已報道的白葉枯病抗性基因已有38 個[15]，但不同抗性基因的抗病力和抗譜卻有較大差別。在目前已鑒定并定位的抗性基因中，Xa23具有抗性強、抗譜廣、抗性持久、表型顯性等特點[8]。本研究選擇已導(dǎo)入Xa23基因的天豐B作為改良特B白葉枯病抗性的供體。從獲得的2個改良系接種白葉枯Ⅳ病菌表現(xiàn)看，Xa23基因?qū)Ｄ习兹~枯病生理小種病菌具有較好的抗性。

3.3利用MAS技術(shù)聚合多個基因的改良型育種

對于表型鑒定困難或鑒定費時費力的一些性狀，MAS育種無需考慮環(huán)境條件對基因表達的影響，可以在苗期或低世代進行選擇。但是，MAS技術(shù)的準(zhǔn)確性依賴于目標(biāo)基因與連鎖標(biāo)記的緊密程度，連鎖越緊密，選擇結(jié)果越可靠。因此開發(fā)與目標(biāo)性狀（基因）緊密連鎖的分子標(biāo)記是進行MAS技術(shù)育種的前提條件。隨著水稻高密度遺傳圖譜的構(gòu)建和水稻全基因組測序的完成，分子標(biāo)記的開發(fā)越來越便捷高效，利用MAS技術(shù)進行有利基因的聚合育種必將成為現(xiàn)代育種的重要途徑，特別是抗性育種[3-4]，但是將抗性基因和優(yōu)良品質(zhì)基因通過MAS技術(shù)聚合在同一個品種中卻不多見?？剐院?、質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高應(yīng)是篩選水稻良種的必然要求。本試驗將低直鏈淀粉合成基因和白葉枯病抗性基因聚合在特B中，檢測表明2個改良系的直鏈淀粉含量和白葉枯病抗性都達到了預(yù)期目標(biāo)。

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