雷 鳴, 朱祖健

(江蘇建康職業(yè)學院解剖學教研室, 江蘇 南京, 210029)

長期大劑量注射D-半乳糖由氧化應激誘導腦衰老的動物模型，是國內(nèi)較公認的研究，但其具體機制尚不明確[1]。研究[2]表明，很多因素參與了D-半乳糖誘導腦衰老的過程，包括鈣穩(wěn)態(tài)、鈉鉀ATP酶活性[3]和膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)[4]等，但對線粒體，尤其是腦線粒體形態(tài)和功能的詳細研究較少。線粒體是細胞能量代謝中心，腦線粒體的結(jié)構和功能對于維持神經(jīng)元的正常功能起著重要作用。研究表明，腦衰老的發(fā)生發(fā)展過程腦線粒體的形態(tài)和功能均出現(xiàn)異常[5]。線粒體呼吸鏈是細胞內(nèi)活性氧(ROS)生成的主要部位，同時也是ROS損傷作用的靶器官。線粒體呼吸鏈功能損傷又會在ATP合成過程中產(chǎn)生更多的ROS, 此惡性循環(huán)加劇了衰老及其相關的神經(jīng)退行性疾病的進程[6]。因此，腦線粒體功能障礙可能是此動物模型的發(fā)病機制之一。本實驗選擇D-半乳糖制備動物模型，通過檢測腦線粒體呼吸鏈復合物的活性，以及電鏡觀察海馬線粒體超微結(jié)構的改變，以探討腦線粒體的形態(tài)和功能在D-半乳糖誘導腦衰老中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物分組及模型制作：健康的雄性C57BL/6小鼠20只(南京醫(yī)科大學動物中心提供)，體質(zhì)量26～28 g。動物隨機分為2組: ① D-半乳糖注射組，小鼠10只，按文獻[4]方法造模復制小鼠衰老模型，腹腔注射D-半乳糖100 mg/(kg·d), 持續(xù)6周; ② 對照組，小鼠10只，腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)6周。D-半乳糖購于武漢博士德公司，線粒體呼吸鏈復合物活性定量檢測試劑盒由南京建成生物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 腦線粒體提?。盒∈髷囝^處死，快速取腦，制備10%腦組織勻漿。4 ℃, 4 000 r/min離心15 min, 棄除上清，充分混懸沉淀。4 ℃, 10 000 r/min離心10 min, 所得沉淀為線粒體。考馬斯亮藍法定量線粒體蛋白濃度。

1.2.2 腦線粒體呼吸鏈復合物活性的檢測：腦線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均參照商品化試劑盒說明書進行實驗，結(jié)果重復3次。

1.2.3 電鏡標本的制作和觀察：透射電鏡標本的制作按常規(guī)流程進行[4], 在JEM1200電鏡下觀察海馬CA1區(qū)線粒體的超微結(jié)構。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 腦線粒體呼吸鏈復合物的活性

與對照組相比, D-半乳糖組腦線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性均顯著降低(表1)。

表1 腦線粒體呼吸鏈復合物的活性

2.2 海馬區(qū)腦線粒體超微結(jié)構的改變

對照組腦線粒體呈橢圓形或圓形，其內(nèi)嵴清晰可見，基質(zhì)均勻(圖1A)。D-半乳糖組腦線粒體的病理改變主要有: ① 線粒體的體積腫脹增大，嵴變短、減少或消失; ② 線粒體變性，主要為水變性，基質(zhì)稀薄，可見空泡(圖1B)。這些變性的線粒體除在既往報道的海馬神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞胞質(zhì)中分布外[7], 還存在于突觸密集區(qū)及星形膠質(zhì)細胞的突起中(圖1C)和腦毛細血管周圍星形膠質(zhì)細胞的終足中(圖1D)。

A. 對照組 40000倍; B. D-半乳糖組 40000倍; C. D-半乳糖組突觸密集區(qū) 25000倍; D. D-半乳糖組毛細血管區(qū) 25000倍

3 討 論

目前，D-半乳糖模型已成為國內(nèi)較公認的研究由氧化應激導致衰老的模型。本實驗研究結(jié)果證實，腦線粒體形態(tài)和功能障礙參與了此動物模型的發(fā)病機制。較之既往僅在外周組織(如肝臟[8]、心肌[9])中探討此模型上的線粒體損傷，本結(jié)果拓展了D-半乳糖研究的領域。結(jié)合以往和本實驗結(jié)果推測，D-半乳糖誘導的氧化應激可能是腦線粒體形態(tài)和功能障礙的一個重要因素。

線粒體呼吸鏈是產(chǎn)生ROS的主要場所, ROS主要來源于呼吸鏈復合物Ⅰ～Ⅳ位點的超氧化陰離子的歧化。正常情況下下，線粒體內(nèi)的多種抗氧化系統(tǒng)，諸如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白等可維持其內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)[10]。然而在氧化應激狀態(tài)下，線粒體也是ROS損傷的敏感靶標，過多的ROS會攻擊線粒體呼吸鏈復合物，導致電子滲漏大量增加以及ATP水平的下降，進而引起蛋白質(zhì)失活、脂質(zhì)過氧化和mtDNA突變等，從而導致線粒體的功能異常，促進衰老和疾病的發(fā)生[11]。本實驗也發(fā)現(xiàn)，模型組腦線粒體呼吸鏈復合物的活性下降。

在此基礎上進一步調(diào)查海馬CA1區(qū)腦線粒體超微結(jié)構的改變：模型組中腫脹扭曲、嵴斷裂和空泡樣變的變性線粒體廣泛分布在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞內(nèi)，神經(jīng)元內(nèi)線粒體的形態(tài)異常與功能障礙將對細胞產(chǎn)生一系列不利影響，如神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙、突觸傳導受阻等，從而導致此模型中廣泛報道的認知和學習障礙。同時進一步觀察星形膠質(zhì)細胞突起內(nèi)線粒體超微結(jié)構的損傷：星形膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)產(chǎn)生的主要場所，而GSH作為腦中抗ROS的主要物質(zhì)之一，能有效阻止其產(chǎn)生，保護神經(jīng)元免受氧化應激的損傷[12]。但由于GSH的合成是一個典型的需要ATP酶的反應過程，星形膠質(zhì)細胞內(nèi)線粒體形態(tài)結(jié)構的損傷將擾亂GSH的正常代謝[13]。因此，星形膠質(zhì)細胞線粒體的變性會降低星形膠質(zhì)細胞的抗氧化能力，加重衰老及衰老相關疾病的發(fā)病進程。

綜上所述，本實驗證實腦線粒體形態(tài)異常和呼吸鏈復合物活性下降參與了D-半乳糖誘導的氧化應激對神經(jīng)元的損傷，因此，應用特異性保護腦線粒體的藥物可能有助于延緩腦衰老的發(fā)生發(fā)展。

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