董麗華, 朱 旭, 姜仕柱, 李琪毅

(1. 三峽大學(xué)仁和醫(yī)院 消化內(nèi)科, 湖北 宜昌, 443001; 2. 重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院 外二科, 重慶, 401120)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其早期確診率不高，被發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已經(jīng)出現(xiàn)肝、肺、骨等全身轉(zhuǎn)移。手術(shù)切除是治療結(jié)腸癌的主要方法，但術(shù)后約70%的患者遠(yuǎn)期生存率不高。結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)較高，且具有較的強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力[1]。研究[2]報(bào)道，RhoA蛋白活性增強(qiáng)可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。茶多酚是茶葉的主要成分，具有很強(qiáng)的抗氧化功能和調(diào)控致癌因子，對(duì)腫瘤形成的各個(gè)階段都有預(yù)防和抑制作用[3]。本實(shí)驗(yàn)通過探討茶多酚對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2凋亡及RhoA蛋白活性的影響，以期為結(jié)腸癌的早期診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2(美國(guó)ATCC公司)，98%的茶多酚(湖南綠蔓生物科技有限公司)，DMEM血清及四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司)，碘化丙啶(南京大治生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶(Gibco公司)，RhoA活性測(cè)定試劑盒(Cytoskeleton公司)，凝膠電泳儀(美國(guó)Bio-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2培養(yǎng)與分組：取出凍存的人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞，快速解凍，加入DMEM培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，胰蛋白酶消化。混勻后離心，懸浮后移入培養(yǎng)瓶，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種后常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期再傳代后，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分4組，分別加入濃度為25、50、100及200 μmol/L的茶多酚，對(duì)照組加入等體積的RPMI-1640培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)12、24、36、48及72 h后檢測(cè)。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察：光鏡及HE鏡下觀察生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞和加入茶多酚后細(xì)胞的不同形態(tài)。

1.2.3 MTT法測(cè)定不同濃度茶多酚在不同作用時(shí)間對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，移入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使其貼壁生長(zhǎng)，分別用不同濃度的茶多酚(25、50、100和200 μmol/L)處理細(xì)胞12、24、36、48及72 h。上機(jī)前4 h培養(yǎng)板每孔加入MTT 20 μL, 然后棄去孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，終止培養(yǎng)；選擇490～570 nm波長(zhǎng)處，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值并記錄結(jié)果。以不同時(shí)間為橫坐標(biāo)，以(1-實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值)作為縱坐標(biāo)，繪制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR), IR=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)：將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，加入10%小牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育24 h后加入茶多酚，濃度分別為25、50、100及200 μmol/L; 另設(shè)對(duì)照組。加藥48 h后，細(xì)胞作FCM樣品制備，分別收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的70%乙醇固定24 h; 檢測(cè)前細(xì)胞懸液用0.01 mmoL PBS洗滌2次，棄上清液；細(xì)胞沉淀中加入150 μL RNA酶A(0.1 mg/mL), 重懸細(xì)胞, 4 ℃避光孵育30 min；再加入120 μL PI染液至終濃度為0.1 mg/mL, 混勻, 4 ℃避光孵育10 min; 將細(xì)胞懸液混勻，用200目尼龍膜過濾細(xì)胞到流式細(xì)胞管，以去除細(xì)胞團(tuán)塊，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 人結(jié)腸癌Caco-2 DNA的提?。喝?duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Caco-2細(xì)胞，以1×104/mL密度接種于6孔板中培養(yǎng)，24 h后分別加入等量生理鹽水和25、50、100及200 μmol/L濃度的茶多酚溶液，培養(yǎng)24 h后離心，加入200 μL細(xì)胞裂解液，重懸細(xì)胞后至濃度為100 μg/mL。60 ℃水浴4 h后，離心，取上清液，加入酚：氯仿：異戊醇500 μL；再離心，取上清液，加入2倍體積無(wú)水酒精，混勻，出現(xiàn)白色絮狀物即為DNA，離心、沉淀、溶解于無(wú)菌純水中，備用。

1.2.6 瓊脂糖凝膠電泳：取10 μL備用的Caco-2 DNA，加入6×上樣緩沖液，混勻后加到新鮮配制的2%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，在90 V/h電壓中電泳、拍照。

1.2.7 RhoA活性測(cè)定：采用Pull-down方法，按照RhoA活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明，按1∶500抗RhoA抗體應(yīng)用Wsetern blot方法檢測(cè)5組不同處理Caco-2細(xì)胞的總RhoA及RhoA蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度茶多酚在不同作用時(shí)間對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2增殖的影響

分別培養(yǎng)12、24、36、48和72 h后，50、100及200 μmol/L濃度組的細(xì)胞增殖活A(yù)值明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 25 μmol/L濃度組在培養(yǎng)24 h后細(xì)胞增殖活A(yù)值亦明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 說(shuō)明茶多酚對(duì)Caco-2細(xì)胞有抑制作用，且隨著藥物濃度的升高，對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，見表1; 不同濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有升高趨勢(shì)，見圖1。

表1 不同濃度茶多酚在不同作用時(shí)間對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2增殖的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05。

圖1 不同濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨時(shí)間的變化

2.2 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)

Caco-2細(xì)胞與茶多酚共同孵育24 h后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡指數(shù)亦增高。25、50、100和200 μmol/L濃度組的細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(26.31±1.49)%、(45.22±1.32)%、(66.14±1.62)%和(75.32±1.64)%, 均明顯高于對(duì)照組(5.12±1.15)%(P<0.01)。

2.3 茶多酚對(duì)人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞DNA的影響

提取人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞DNA, 進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，由于細(xì)胞凋亡程度不同，因此在電泳時(shí)凋亡細(xì)胞的DNA條帶表現(xiàn)呈彌散狀分布及梯狀條帶，被認(rèn)為是典型的凋亡指標(biāo)，說(shuō)明茶多酚能促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2的凋亡，且隨著濃度的增加對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加(圖2)。

DNA電泳條帶從左到右依次為DNA Marker、25、50、100及200 μmol/L

2.4 RhoA蛋白活性檢測(cè)結(jié)果

各組細(xì)胞均在相對(duì)分子質(zhì)量為30 000處可見1條與RhoA相符的清晰條帶，每組細(xì)胞均包括RhoA蛋白及活性RhoA蛋白2個(gè)條帶，各組間RhoA總蛋白表達(dá)無(wú)差別，但與對(duì)照組比較，其活性RhoA蛋白水平下調(diào)。通過對(duì)總RhoA表達(dá)量來(lái)校正，以活性RhoA與總RhoA比值進(jìn)行分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

1. 對(duì)照組; 2. 25 μmol/L組; 3. 50 μmol/L組; 4. 100 μmol/L組; 5. 200 μmol/L組; A. 活性RhoA蛋白; T. 總RhoA蛋白

3 討 論

茶多酚具有抗氧化、清除自由基、調(diào)節(jié)致癌因子及抑制腫瘤血管生成等作用，能夠預(yù)防和治療多種腫瘤[4]，但其抗癌機(jī)制尚不明確。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚可顯著降低荷瘤小鼠血清丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，提示茶多酚可通過增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶的活性、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生抗癌作用。Caco-2細(xì)胞來(lái)源于人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞，能分化形成具有小腸上皮細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)，表達(dá)多種蛋白載體和酶，在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的組織中，其表達(dá)增高，并且在轉(zhuǎn)移的過程中，發(fā)揮著重要的作用。Li等[6]研究表明，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2活性，促進(jìn)其凋亡，可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Shimizu等[7]研究表明，茶多酚復(fù)合體及主要兒茶素單體對(duì)氧自由基的消除率達(dá)98%以上，在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。徐靜等[8]研究表明，結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2凋亡，與誘導(dǎo)劑(熊去鵝膽酸)濃度及時(shí)間呈正向相關(guān)性。Singh等[9]對(duì)茶多酚通過Fas相關(guān)死亡域蛋白(FADD)依賴方式介導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)不同濃度的茶多酚能誘導(dǎo) DNA 片段化，并與劑量相關(guān)；高濃度的茶多酚(>800 mg/mL)能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞溶解。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶多酚和Caco-2細(xì)胞共孵育12 h后，50、100和200 μmol/L濃度組的細(xì)胞增殖活A(yù)值分別為(0.1052±0.0192)、(0.0975±0.0154)和(0.0912±0.0134), 明顯低于對(duì)照組(0.01239±0.0154); 25 μmol/L濃度組在培養(yǎng)24 h后比較，細(xì)胞增殖活A(yù)值為(0.1072±0.0124), 亦明顯低于對(duì)照組(0.1236±0.0146); 隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各藥物濃度組細(xì)胞增殖活性呈降低趨勢(shì)，說(shuō)明茶多酚能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2增殖，且具有時(shí)間和濃度依賴性。

GU等[10]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中RhoA活性增加與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。RhoA屬于Rho家族蛋白的Rho亞家族成員，與Ras蛋白相同，是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，可通過多種信號(hào)途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和細(xì)胞周期。Yang等[11]通過RNAi技術(shù)沉默RhoA的表達(dá)，抑制體內(nèi)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Wang等[12]研究表明, RhoA可以調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，是改變細(xì)胞骨架組裝，調(diào)控細(xì)胞遷移，參與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子，同時(shí)還可促進(jìn)腫瘤血管的生成。王德盛等[13]應(yīng)用siRNA于血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RhoA在mRNA和蛋白水平均下調(diào)，凋亡細(xì)胞上升4倍，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)被強(qiáng)烈抑制，且內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力被抑制，并有劑量依賴效應(yīng)，內(nèi)皮細(xì)胞的乳頭狀腔管形成能力也下降。此外，大量體外研究[14-16]發(fā)現(xiàn)，RhoA參與腫瘤細(xì)胞的黏附、收縮和移動(dòng)、黏附結(jié)合的解除、基質(zhì)的降解及對(duì)血管和淋巴脈管系統(tǒng)侵入等過程的調(diào)控，涉及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的各個(gè)環(huán)節(jié)中。本實(shí)驗(yàn)中提取人結(jié)腸癌Caco-2 細(xì)胞DNA, 進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，結(jié)果顯示凋亡的Caco-2細(xì)胞DNA條帶表現(xiàn)呈彌散狀分布及梯狀條帶，進(jìn)一步行RhoA蛋白活性檢測(cè)，結(jié)果顯示濃度組間RhoA總蛋白表達(dá)無(wú)差別，但與對(duì)照組比較，其活性RhoA蛋白水平下調(diào)，提示通過利用茶多酚抑制Caco-2細(xì)胞中RhoA表達(dá)，可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

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