吳 林, 宦宏波, 吳黎靂, 別 平，夏 鋒

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院 全軍肝膽外科研究所, 重慶, 400038)

Kupffer細(xì)胞是人體內(nèi)數(shù)量最多的巨噬細(xì)胞，約占巨噬細(xì)胞總數(shù)的80%～90%[1]。它構(gòu)成了肝臟先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有吞噬和殺滅細(xì)菌、凋亡細(xì)胞、微生物、內(nèi)毒素、免疫復(fù)合物等功能[2-3]; 另一方面, Kupffer細(xì)胞在發(fā)揮免疫功能的同時(shí)釋放白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)等炎癥因子參與反應(yīng)[3-6], 而先前研究證實(shí)炎癥反應(yīng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起決定性因素[7-9]，而且炎癥因子進(jìn)一步參與了腫瘤干細(xì)胞的自我更新和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT), 促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[10-11]。近年來有研究[12-13]報(bào)道Kupffer細(xì)胞通過釋放炎癥因子參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于Kupffer細(xì)胞分泌的炎癥因子和肝癌干細(xì)胞標(biāo)志在肝癌發(fā)生發(fā)展中的動態(tài)表達(dá)及其相關(guān)性尚未見報(bào)道。本研究通過建立大鼠肝癌誘導(dǎo)模型，采用定量PCR方法檢測肝癌發(fā)展過程中不同時(shí)間點(diǎn)Kupffer細(xì)胞分泌的炎癥因子及肝癌干細(xì)胞標(biāo)志的動態(tài)變化，并對2者相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD雄性大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)動物中心)、二乙基亞硝胺(DEN, 0.95 g/mL, 美國Sigma公司)、ED2抗體(英國Serotec AbD公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS，中杉金橋)、免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(中杉金橋)、DAB顯色試劑盒(中杉金橋)、Trizol(日本Takara公司)、PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)、SYBR Green(日本Takara公司)、引物合成(北京華大基因公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

Olympus顯微鏡(日本Olympus公司)、ND1000微量分光光度計(jì)(美國Nano Drop公司)、CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肝癌誘導(dǎo)大鼠模型建立: SD雄性大鼠35只(180 g～200 g, 第三軍醫(yī)大學(xué)動物中心)，隨機(jī)分為正常對照組(5只)，誘導(dǎo)模型組按誘癌時(shí)間點(diǎn)分為: 4周、8周、12周、16周、20周、24周(每組5只)。24周組每只大鼠肝臟組織又分為癌和癌旁2個(gè)亞組: 24-周-NT(癌旁)、24-周-T(癌)。誘導(dǎo)模型組大鼠按每天10 mL/100 mg body weight飲水中給予DEN溶液(0.01% v/v), 每周僅給予6天DEN溶液，剩余1 d給予普通飲水。正常對照組給予普通飲水。在誘癌過程中，每隔4周取材誘癌模型組5只大鼠的肝臟, -80 ℃冷藏備用，直至誘癌第24周肝癌形成。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測誘癌過程中Kupffer細(xì)胞ED2表達(dá)：大鼠肝臟組織常規(guī)甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片、烤片后，按免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行。脫蠟后, 3% H2O2封閉，抗原修復(fù)，山羊血清封閉，一抗ED2(1∶200)4 ℃冰箱過夜，滴加酶標(biāo)抗體，通用二抗結(jié)合, DAB顯色。

各試驗(yàn)組ED2陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)計(jì)算方法：每只大鼠計(jì)數(shù)平均5個(gè)高倍鏡視野下每100個(gè)細(xì)胞中ED2陽性細(xì)胞表達(dá)分?jǐn)?shù)，取均值和標(biāo)準(zhǔn)差后計(jì)算每一組大鼠ED2陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測炎癥因子和肝癌干細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)：所有操作均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。常規(guī)Trizol提取各組大鼠肝臟組織RNA, 測定RNA濃度后，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)為cDNA，加入特定引物(引物序列見表1)，用SYBR Green試劑盒實(shí)時(shí)定量PCR檢測Kupffer細(xì)胞釋放的相關(guān)炎癥因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和肝癌干細(xì)胞指標(biāo)CD90、CD133、Sirt1、AFP各基因表達(dá), GAPDH作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。誘癌過程中，各試驗(yàn)組Kupffer細(xì)胞ED2陽性分?jǐn)?shù)、Kupffer細(xì)胞相關(guān)炎癥因子表達(dá)和肝癌干細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)均采用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較。炎癥因子與肝癌干細(xì)胞指標(biāo)之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌模型的建立

通過對誘導(dǎo)模型組大鼠飲水中加入DEN溶液，大鼠肝癌演變過程表現(xiàn)為經(jīng)典的炎癥反應(yīng)期(1～12周)、肝增生纖維化期(12～16周)、肝硬化形成期(16～20周)、肝癌形成期(20～24周)(見圖1, A-N)。到誘癌24周時(shí), 24周組大鼠均發(fā)現(xiàn)肝癌形成。

表1 引物合成序列

圖1 大鼠肝癌誘導(dǎo)模型建立及Kupffer細(xì)胞在誘癌過程中的動態(tài)變化100倍

2.2 大鼠肝癌誘導(dǎo)過程中Kupffer細(xì)胞ED2表達(dá)

通過免疫組化染色檢測Kupffer細(xì)胞特異性抗體ED2，觀察大鼠肝癌誘導(dǎo)過程中ED2動態(tài)表達(dá)，免疫組化結(jié)果提示ED2在肝癌誘導(dǎo)過程中表達(dá)逐漸增多(圖1, O-U), 并通過統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算出各組ED2陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明ED2在肝癌誘導(dǎo)過程中呈逐漸升高的趨勢(P<0.001)。而且從誘癌第12周開始，12周、16周、20周和24周的ED2的表達(dá)與正常對照組有明顯差異性(P<0.01)。該結(jié)果表明Kupffer細(xì)胞數(shù)量在誘癌過程中呈逐漸增多的趨勢。(圖2)。

2.3 大鼠肝癌誘導(dǎo)過程中Kupffer細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的動態(tài)表達(dá)

注：**P<0.05

通過定量PCR方法檢測鼠肝癌誘導(dǎo)過程中Kupffer細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的動態(tài)表達(dá)，結(jié)果表明IL-6(P<0.001)、MCP-1(P<0.001)、TGF-β(P=0.003)和TNF-α(P=0.047)在誘癌過程中明顯升高(圖3 A,B,C,D), 而且與正常肝臟組織相比較，在肝癌組織中IL-6(P<0.001)、MCP-1(P<0.001)和TGF-β(P<0.001)表達(dá)更高，而其它炎癥因子在誘癌過程中無明顯變化(圖3, E-I,P>0.05)。

2.4 大鼠肝癌誘導(dǎo)過程中肝癌干細(xì)胞標(biāo)志的動態(tài)表達(dá)

注：**P<0.05

通過定量PCR方法檢測鼠肝癌誘導(dǎo)過程中肝癌干細(xì)胞標(biāo)志的動態(tài)表達(dá)，結(jié)果表明CD90在誘癌過程中呈逐漸升高的趨勢(P<0.001)，特別是與正常肝臟組織比較，肝癌組織中CD90升高更明顯(圖4 A;P<0.001)。CD133雖然呈一定升高趨勢，但ANOVA分析其結(jié)果無明顯變化(P=0.125), 同時(shí)其它肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物在誘癌過程中無明顯變化(圖4 B,C,D;P>0.05)

注：**P<0.05

2.5 Kupffer相關(guān)炎癥因子與肝癌干細(xì)胞標(biāo)志的相關(guān)性

通過以上結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析篩選出在誘癌過程中差異性表達(dá)的Kupffer相關(guān)炎癥因子: IL-6、MCP-1、TGF-β和TNF-α, 以及差異性表達(dá)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志CD90。將肝癌誘導(dǎo)過程中CD90與IL-6、MCP-1、TGF-β和TNF-α的動態(tài)表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明IL-6、MCP-1、TGF-β和CD90的表達(dá)呈明顯正相關(guān)性(圖5 A,B,C;P<0.001), 而TNF-α與CD90表達(dá)無明顯相關(guān)性(圖5 D;P=0.288)。

圖5 肝癌誘導(dǎo)過程中CD90與Kupffer細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的相關(guān)性分析

3 討 論

本研究首先通過DEN誘導(dǎo)成功建立經(jīng)典大鼠肝硬化肝癌模型，在誘癌24周時(shí)發(fā)現(xiàn)肝臟腫瘤，然后對各組大鼠采用免疫組織化學(xué)方法檢測了Kupffer細(xì)胞的特異性抗體ED2[14-15]在肝癌誘導(dǎo)過程中的動態(tài)變化，結(jié)果表明ED2陽性細(xì)胞在誘癌過程中逐漸升高(圖2;P<0.001)。采用定量PCR方法檢測了Kupffer細(xì)胞釋放的炎癥因子在誘癌過程中的表達(dá)變化，結(jié)果篩查出IL-6(P<0.001)、MCP-1(P<0.001)、TGF-β(P=0.003)和TNF-α(P=0.047)在誘癌過程中變化明顯(圖3 A,B,C,D); 同時(shí)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物篩查出CD90指標(biāo)在誘癌過程中呈明顯升高趨勢(圖4 A;P<0.001)。通過Pearson檢驗(yàn)分析IL-6、MCP-1、TGF-β、TNF-α與CD90的相關(guān)性，提示IL-6、MCP-1、TGF-β與CD90的表達(dá)明顯相關(guān)(圖5 A,B,C;P<0.001)。從而證明Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

許多研究證實(shí)炎癥因子與腫瘤發(fā)生之間存在密切關(guān)系。Naugler WE等[12]通過研究DEN對不同性別大鼠肝癌形成的影響，證明雌性大鼠通過雌激素調(diào)控Kupffer細(xì)胞上Toll樣受體銜接蛋白MyD88，抑制壞死肝細(xì)胞釋放IL-6以及清除循環(huán)血液中的IL-6, 從而達(dá)到抑制化學(xué)性誘癌的發(fā)生。Wu K等[16]在一部分大鼠及人體肝癌組織中發(fā)現(xiàn)肝臟前體細(xì)胞共表達(dá)腫瘤初始細(xì)胞標(biāo)志(T-IC), 同時(shí)TGF-β的表達(dá)與T-IC的表達(dá)呈正相關(guān)性，而在缺乏TGF-β的情況下卻不能啟動肝癌的發(fā)生，從而證明了TGF-β在肝癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。Wang WW等[17]通過蛋白抗體芯片檢測了58例肝癌切除患者及11例乙肝病毒攜帶者的血清蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)113種血清標(biāo)志物被調(diào)控，其中MCP-1的變化最為明顯，而且MCP-1有希望作為AFP的一種補(bǔ)償標(biāo)志物，通過ELISA常規(guī)定量檢測患者血清MCP-1濃度，從而幫助臨床預(yù)測和診斷肝癌。Yang ZF等[18]對肝癌患者循環(huán)血液及肝癌組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn), CD45-、CD90+細(xì)胞可以在90%的肝癌患者循環(huán)血液及肝癌組織中被檢測，證明CD90可以作為檢測和診斷肝癌的一個(gè)重要標(biāo)志物。

部分研究也明確了炎癥因子與腫瘤干細(xì)胞之間的相關(guān)性。Jin X等[10]證明在腦腫瘤發(fā)生過程中，干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF-7)可以通過IL-6和Notch信號通路誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的產(chǎn)生以及血管生成。此外, Li Y[11]等通過研究結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-1β可以通過激活腫瘤干細(xì)胞的自我更新及EMT促進(jìn)結(jié)腸癌的生長與侵襲。Korkaya H等[19]對曲妥珠單抗的耐藥乳腺癌細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn), IL-6炎癥反饋通路導(dǎo)致了腫瘤干細(xì)胞的擴(kuò)增，長時(shí)間通過曲妥珠單抗處理的細(xì)胞系篩選出大量的腫瘤干細(xì)胞，這些腫瘤干細(xì)胞表現(xiàn)出EMT現(xiàn)象及其分泌的IL-6相比普通細(xì)胞系表達(dá)高出近百倍，同時(shí)通過阻斷IL-6受體可以明顯降低腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。以上試驗(yàn)均表明炎癥因子對腫瘤干細(xì)胞的重要調(diào)控作用，而Kupffer細(xì)胞釋放的相關(guān)炎癥因子與肝癌干細(xì)胞標(biāo)志CD90的相關(guān)性尚未見報(bào)道。

本研究尚存在一些不足之處: ① Kupffer細(xì)胞相關(guān)炎癥因子促進(jìn)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)的具體機(jī)制還需進(jìn)一步功能學(xué)試驗(yàn)明確; ②本試驗(yàn)結(jié)果篩查出CD90與Kupffer細(xì)胞釋放的炎癥因子明顯相關(guān)，但其它肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物與炎癥因子的相關(guān)性還需進(jìn)一步探討。因此，作者設(shè)想下一步是否可以通過抑制Kupffer細(xì)胞釋放的炎癥因子，或?qū)upffer細(xì)胞清除達(dá)到降低甚至抑制肝癌的發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Kupffer細(xì)胞釋放的炎癥因子IL-6、MCP-1、TGF-β的表達(dá)升高與CD90上調(diào)呈明顯正相關(guān)，進(jìn)一步明確了Kupffer細(xì)胞促進(jìn)肝癌發(fā)生的重要作用。因此, Kupffer細(xì)胞可以作為潛在的肝癌治療靶點(diǎn)為肝癌的臨床診治開辟新的領(lǐng)域。

[1]Liaskou E, Wilson D V, Oo YH. Innate immune cells in liver inflammation[J]. Mediators Inflamm, 2012, 2012: 949157.

[2]Kolios G, Valatas V, Kouroumalis E. Role of kupffer cells in the pathogenesis of liver disease[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(46): 7413.

[3]Laskin D L. Macrophages and Inflammatory Mediators in Chemical Toxicity: A Battle of Forces[J]. Chem Res Toxicol, 2009, 22(8): 1376.

[4]Helk E, Bernin H, Ernst T, et al. TNFα-mediated liver destruction by Kupffer cells and Ly6Chi monocytes during Entamoeba histolytica infection[J]. PLoS Pathog, 2013, 9(1): e1003096.

[5]Lucey, M. R., P. Mathurin, et al. Alcoholic hepatitis[J]. N Engl J Med, 2009, 360(26): 2758.

[6]Xu L, Yin W, Sun R, et al. Kupffer cell-derived IL-10 plays a key role in maintaining humoral immune tolerance in hepatitis B virus-persistent mice[J]. Hepatology, 2013, doi: 10.1002/hep.26668.[Epub ahead of print]

[7]Grivennikov S I, Greten F R, Karin M. Immunity, Inflammation, and Cancer[J]. Cell, 2010, 140(6): 883.

[8]Park E J, Lee J H, Yu G Y, et al. Dietary and genetic obesity promote liver inflammation and tumorigenesis by enhancing IL-6 and TNF expression[J]. Cell, 2010, 140(2): 197.

[9]Ben-Neriah Y, Karin M. Inflammation meets cancer, with NF-κB as the matchmaker[J]. Nat Immunol, 2011, 12(8): 715.

[10]Jin X, Kim S H, Jeon H M, et al. Interferon regulatory factor 7 regulates glioma stem cells via interleukin-6 and Notch signalling[J]. Brain, 2012, 135(Pt 4): 1055.

[11]Li Y, Wang L, Pappan L, et al. IL-1β promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation[J]. Mol Cancer. 2012, 11: 87.

[12]Naugler W E, Sakurai T, Kim S, et al. Gender Disparity in Liver Cancer Due to Sex Differences in MyD88-Dependent IL-6 Production[J]. Science, 2007, 317(5834): 121.

[13]Maeda S, Kamata H, Luo J L, et al. IKKbeta couples hepatocyte death to cytokine-driven compensatory proliferation that promotes chemical hepatocarcinogenesis[J]. Cell, 2005, 121(7): 977.

[14]Tapia G, Santibá?ez C, Farías J, et al. Kupffer-cell activity is essential for thyroid hormone rat liver preconditioning[J]. Mol Cell Endocrinol, 2010, 323(2): 292.

[15]Golbar H M, Izawa T, Murai F, et al. Immunohistochemical analyses of the kinetics and distribution of macrophages, hepatic stellate cells and bile duct epithelia in the developing rat liver[J]. Exp Toxicol Pathol, 2012, 64(1/2): 1.

[16]Wu K, Ding J, Chen C, et al. Hepatic Transforming Growth Factor Beta Gives Rise to Tumor-Initiating Cells and Promotes Liver Cancer Development[J]. Hepatology, 2012, 56(6): 2255.

[17]Wang W W, Ang S F, Kumar R, et al. Identification of serum monocyte chemoattractant protein-1 and prolactin as potential tumor markers in hepatocellular carcinoma[J]. PLOS ONE, 2013, 8(7): e68904.

[18]Yang Z F, Ngai P, Ho D W, et al. Identification of Local and Circulating Cancer Stem Cells in Human Liver Cancer[J]. Hepatology, 2008, 47(3): 919.

[19]Korkaya H, Kim G I, Davis A, et al. Activation of an IL6 inflammatory loop mediates trastuzumab resistance in HER2+ breast cancer by expanding the cancer stem cell population[J]. Mol Cell. 2012, 47(4): 570.