★ 吳丹 余永紅

(1.江西省藥品審評中心 江西 南昌 330046;2.江西省食品藥品檢驗(yàn)所 江西 南昌 330029)

殼聚糖的免疫調(diào)節(jié)功能被廣泛研究，殼聚糖灌胃處理可以使小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)增高，細(xì)胞免疫、體液免疫、單核-巨嗜細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性增強(qiáng)[1,2]。黃俊民等研究表明殼聚糖能提高綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力，增強(qiáng)小鼠的血清溶血素抗體反應(yīng)和巨嗜細(xì)胞的吞噬反應(yīng)[3]。殼聚糖膠囊為口服固體保健食品，其有效成分D-氨基葡萄糖鹽酸鹽含量大于85.1g/100g，本實(shí)驗(yàn)對其增強(qiáng)免疫功能進(jìn)行了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品 殼聚糖膠囊內(nèi)容物。折合劑量0.033 3g/kg·bw(成人體重以60kg計)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 昆明種雌性小鼠，200只，SPF級，重18～22g。購自江西中醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心(實(shí)驗(yàn)動物合格號：JZDWNO.2013-0137)。

1.1.3 主要儀器 分光光度計：722型，上海精科儀器有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱：MCO-20AIC，日本三洋電器集團(tuán)；酶標(biāo)儀：PT-3502，北京普天新橋技術(shù)有限公司；顯微鏡：BX53，奧林巴斯中國有限公司；24孔、96孔平底培養(yǎng)板和U型96孔培養(yǎng)板：上海臥宏生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 將200只實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分組：I(碳廓清)、II(腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞)、III(遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng))、IV(臟體比值、半數(shù)溶血值和抗體生成細(xì)胞數(shù)的測定)、V(ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、NK細(xì)胞活性測定)。每組設(shè)低、中、高劑量組及對照組。每組為10只小鼠[4]。

1.2.2 劑量選擇及樣品處理 按體重設(shè)0.167g/kg·bw(低)、0.333g/kg·bw(中)、1.000g/kg·bw(高)三個劑量，配制時分別取殼聚糖內(nèi)容物1.67g、3.33g、10.00g用1%CMC定容至200mL，給小鼠灌胃(0.2mL/10g·bw)，對照組予以等體積的1%CMC，每天1次，連續(xù)灌胃30d[4]。

1.2.3 臟器重和體重測定 處死小鼠前稱重，解剖取胸腺和脾臟并稱重，計算胸腺/體重和脾臟/體重比值[4]。

1.2.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH) 用0.2mL的2%(v/v)SRBC對每只小鼠注射腹腔致敏，4d后測量左后足跖厚度，在測量部位用20μL的20%(v/v)SRBC對每只小鼠行皮下注射，于24h后再次測量左后足跖厚度，測3次取平均值，計算攻擊前后足跖厚度之差[4]。

1.2.5 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(MTT法) 無菌操作取脾置于Hank's溶液中制備細(xì)胞懸液，過200目篩；用Hank's溶液洗滌并離心(10min，1 000r/min)2次；將細(xì)胞移入1mL完全培養(yǎng)液中計數(shù)，再用RPMI1640溶液配制濃度為3×106個/mL的細(xì)胞液；分2孔加入24孔培養(yǎng)板，每孔1mL，一孔為5%CO2對照，另一孔加75μLConA(濃度為75μg/mL)液，37℃培養(yǎng)68h后從各孔小心吸去0.7mL上清液，再加0.7mLRPMI1640培養(yǎng)液(不含小牛血清)和MTT50μL(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)至72h；再往各孔加1mL酸性異丙醇，吹打混勻，溶解紫色結(jié)晶后分裝至96孔板，各設(shè)3個平行樣，570nm處測定OD1和OD2值，計算公式[4]：

R=OD1-OD2

R：淋巴細(xì)胞增殖能力；OD1：光密度(加ConA)；OD2：光密度(不加ConA)。

1.2.6 抗體生成細(xì)胞檢測 用生理鹽水(NS)洗滌羊血3次，每次離心(10min，2 000r/min)得壓積SRBC，再用NS制備的2%(v/v)細(xì)胞懸液注射小鼠腹腔(每只0.2mL)，4d后，無菌取脾小心磨碎，用Hank's液制備濃度為5×106個/mL的細(xì)胞懸液；將溶解好的表層培養(yǎng)基與等量2倍濃度Hank's液(pH7.4)混合，以每試管0.5mL用量分裝，再加50μL 10%(v/v)SRBC和20μL細(xì)胞懸液，迅速混勻，傾倒于制備好的瓊脂糖玻片上，凝固好將玻片平扣于玻片架上，用CO2培養(yǎng)箱溫育1.5h，在玻片凹槽中倒入補(bǔ)體(用SA液1∶8比例稀釋)繼續(xù)溫育1.5h，計數(shù)溶血空斑[4]。

1.2.7 半數(shù)溶血值(HC50)的測定 用羊血制備0.2mL 2%(v/v)SRBC并注射小鼠腹腔進(jìn)行免疫，4d后摘眼球以離心管取血，靜置1h，離心(10min，2 000r/min)收集血清，用SA緩沖液稀釋至200倍后取1mL到試管中，順次加入0.5mL 10%(v/v)SRBC(SA配置)、補(bǔ)體1mL(用SA液1∶8比例稀釋)；并設(shè)SA對照組。水浴37℃保溫30min后冰浴終止反應(yīng)，離心(10min，1 900r/min)，取1mL上清液和3mL都氏試劑到試管中，于另一試管中加0.25mL 10%(v/v)SRBC(SA配置)和3.75mL都氏試劑，混勻靜置12min，在540nm處測OD值，對照作空白，計算公式[4]：

HC50=OD1值/OD2值×R

HC50：半數(shù)溶血值；OD1：樣品OD值；OD2：SRBC半數(shù)溶血OD值；R：稀釋倍數(shù)。

1.2.8 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn) 印度墨汁用NS稀釋4倍，在小鼠尾靜脈進(jìn)行注射(0.01mL/g)，注射完立即計時，于第2min、10min分別從內(nèi)眥靜脈叢采血20μL，加入到2mL 0.1%Na2CO3溶劑中混勻；溶劑為空白對照，在600nm處測OD值。解剖小鼠取肝和脾稱重，計算吞噬指數(shù)a[4]。

1.2.9 小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 離心制備雞紅細(xì)胞(1 900r/min，離心10min)，用NS配置成20%(v/v)細(xì)胞懸液，取1mL注射小鼠腹腔，30min后處死以鼠板固定，從腹部中央剪開皮膚，注射2mL NS，轉(zhuǎn)動鼠板約1min制備腹腔巨噬細(xì)胞洗液，取1mL滴于載玻片上，在保濕盒中溫育后(37℃，30min)，以NS漂洗，晾干，以丙酮：甲醇(1∶1)溶液固定，再用4%(v/v)Giemsa-PBS液染色，再漂洗，再晾干，顯微鏡下計數(shù)(每個玻片計數(shù)100個)，計算公式[4]：

A%=B/C×100

A：吞噬率%；B：吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)；C：計數(shù)的巨嗜細(xì)胞數(shù)。

T=Y/C

T：吞噬指數(shù)；Y：被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)；C：計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)。

1.2.10 NK細(xì)胞活性的測定 處死小鼠后無菌取脾，脾細(xì)胞用Hank's液洗滌、離心(10min，1 000 r/min)2次，棄上清，加0.5mL無菌水，待紅細(xì)胞裂解后(約20s)，再加0.5mL 2倍Hank's液和8mL Hank's液，離心處理(1 000 r/min，10min)，再重懸(用1mL含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液)，用臺酚蘭染色計數(shù)；再將活細(xì)胞濃度調(diào)整至2×107個/mL，此為效應(yīng)細(xì)胞，配制細(xì)胞濃度為4×105個/mL的YAC-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞(RPMI1640培養(yǎng)液)；各取100μL(效∶靶=50∶1)到96孔U型板中培養(yǎng)，將培養(yǎng)液和靶細(xì)胞各100μL加到靶細(xì)胞自然釋放孔中，將靶細(xì)胞和2.5%Triton各100μL加到靶細(xì)胞最大釋放孔中，均需設(shè)3個平行樣，37℃,5% CO2培養(yǎng)4h后離心(5min，1 500r/min)，取100μL上清液到96孔平底培養(yǎng)板中，并加LDH基質(zhì)100μL，室溫反應(yīng)3～10min，各孔加1mol/L的HCL30μL，490nm處測定，計算公式[4]：

A=[(OD1-OD2)/(OD3-OD2)]×100%

A：NK細(xì)胞活性；OD1：反應(yīng)孔OD值；OD2：自然孔釋放OD值；OD3：最大釋放孔OD值。

2 結(jié)果

2.1 對體重和臟器/體重比的影響 體重觀測發(fā)現(xiàn)，各劑量組小鼠體重變化、脾臟/體重比及胸腺/體重比，與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。

2.2 對細(xì)胞免疫的影響 表1表明，高劑量組小鼠足跖腫脹程度顯著高于對照組(P<0.01)，且能顯著增加小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力(P<0.05)。

表1 對細(xì)胞免疫的影響

2.3 對體液免疫的影響 由表2可知，高劑量組能顯著增加抗體生成細(xì)胞數(shù)和半數(shù)溶血值(P<0.05)。中、高劑量能顯著增加NK細(xì)胞活性(P<0.05)。各劑量對小鼠單核-巨噬細(xì)胞能力和小鼠巨嗜細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力無明顯影響，與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。

表2 對體液免疫的影響

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)研究表明，經(jīng)口給予小鼠0.167g/kg·bw(低)、0.333g/kg·bw(中)、1.000g/kg·bw(高)三個劑量殼聚糖膠囊內(nèi)容物30d，高劑量可以增加小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、抗體生成細(xì)胞數(shù)、血清半數(shù)溶血值，與對照組比較具有顯著差異性(P<0.05或P<0.01)；中、高劑量能增加小鼠NK細(xì)胞活性，與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；對小鼠體重增長、脾臟/體重比值、胸腺/體重比值及小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力無明顯影響(P>0.05)。提示該殼聚糖膠囊產(chǎn)品具有增強(qiáng)免疫力的功能。

[1]王曉玲．甲殼素和殼聚糖在食品工業(yè)中應(yīng)用的新進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2007，28(10)：163-166.

[2]雷朝亮，鐘昌珍．蠅蛆幾丁糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997，16(3)：259-262.

[3]黃俊民，吳麗明，陳瑞儀．甲殼素和殼聚糖對小鼠免疫調(diào)節(jié)的研究[J].廣東衛(wèi)生防疫，1999，25(1)：4-6.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部．保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范[M].北京：2003：961-1001.