★ 菅曉勇 鄧雙炳

(1.北京康樂(lè)衛(wèi)士生物技術(shù)股份有限公司 北京 100176；2.北京博愛(ài)匯康醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司 北京 100176)

黃芪藥材[Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge]為常用補(bǔ)中益氣類(lèi)中藥，在抗腫瘤、抗疲勞、增強(qiáng)免疫等方面具有廣泛的藥理活性，而這些諸多藥理活性的體現(xiàn)源于中草藥內(nèi)在的多種活性成分綜合相互作用的結(jié)果。黃芪素以“炮臺(tái)芪”的質(zhì)優(yōu)、純正享譽(yù)海內(nèi)外，且與藥材具體的基源、產(chǎn)地和生長(zhǎng)年限有著千絲萬(wàn)縷的密切聯(lián)系，其中尤以體現(xiàn)在主要的有效化學(xué)成分皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)以及多糖類(lèi)的含量方面[1-4]。然而《中國(guó)藥典》(2010版)中僅規(guī)定黃芪甲苷和毛蕊異黃酮苷含量作為黃芪質(zhì)量的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，顯然不能全面地反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量，需要探索更為科學(xué)的評(píng)價(jià)指標(biāo)和體系，近幾年的研究前景顯示多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)體系用于黃芪質(zhì)量評(píng)價(jià)可能具有更好的應(yīng)用前景[4-6]。

為此，本文對(duì)黃芪藥材含有的5種主要有效(活性)化學(xué)成分的總量和基于《中國(guó)藥典》(2010版)的3種相關(guān)單一成分分別進(jìn)行含量測(cè)定并歸納分析，對(duì)分析測(cè)定結(jié)果進(jìn)行多指標(biāo)、多元分析，研究黃芪藥材內(nèi)在有效成分含量之間的相關(guān)性，以期為黃芪質(zhì)量評(píng)價(jià)和內(nèi)在質(zhì)量控制方法的科學(xué)性、合理性以及簡(jiǎn)便化，尤以探索黃芪藥材質(zhì)控方法的“一測(cè)多評(píng)”提供可能的研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材 本文研究所用的黃芪樣品均為原產(chǎn)地實(shí)地采集或購(gòu)于當(dāng)?shù)?No.1-No.10)，全部樣品均經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林老師鑒定基源為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch) Bge var.mongholicus(Bge)Hsiao(除No.1)。上述藥材待自然干燥后截成小段，60°C烘箱中干燥6～8h，粉碎過(guò)篩后，作為含量測(cè)定用樣品，見(jiàn)表1。

1.2 對(duì)照品及試劑 葡聚糖、蘆丁、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷對(duì)照品均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)食品藥品檢定研究院(含量測(cè)定用)；化學(xué)試劑：乙腈和甲醇均為色譜純級(jí)，其他試劑為分析純級(jí)。

1.3 儀器 安捷倫1260型液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)；Chromachem-6100型ELSD檢測(cè)器(美國(guó)ESA公司)；UV5100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；BSA224S-CW型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)，HH-4型數(shù)字化顯示恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；320-S型酸度計(jì)(瑞士梅特勒-托利多公司)。

表1 不同產(chǎn)地來(lái)源、生長(zhǎng)年限的10批黃芪藥材樣品

注：上述10批次黃芪藥材樣品均為當(dāng)?shù)仉S機(jī)上山采集或當(dāng)?shù)夭杉箅S機(jī)購(gòu)買(mǎi)。

圖1 黃芪藥材黃芪甲苷HPLC圖譜(c峰為黃芪甲苷峰)

2 測(cè)定方法與含量結(jié)果

2.1 黃芪甲苷的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm)；ELSD參數(shù)：霧化溫度：35°C，蒸發(fā)溫度：50°C，氮?dú)鈮毫Γ?.5 bar；流動(dòng)相為乙腈∶水(32∶68)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20μL；分離度、理論板數(shù)等應(yīng)符合藥典要求。

2.1.2 配制對(duì)照品溶液 黃芪甲苷對(duì)照品精密稱(chēng)定5mg，加甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配制成0.5 mg/L的溶液，4°C冰箱保存，備用。

2.1.3 測(cè)定方法 參照《中國(guó)藥典》(2010年版Ⅰ部)黃芪項(xiàng)下規(guī)定的樣品處理及測(cè)定方法進(jìn)行黃芪甲苷含量的測(cè)定(見(jiàn)圖1)，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算黃芪甲苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 黃芪多糖的含量測(cè)定

2.2.1 制備蒽酮-濃硫酸溶液(0.2%)及葡聚糖對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)定蒽酮適量，緩慢加入至已置于避光棕色瓶中的濃硫酸溶液中，配制成0.2%的蒽酮-濃硫酸溶液，4°C冰箱保存，備用。

購(gòu)買(mǎi)的葡聚糖對(duì)照品首先經(jīng)105°C干燥至恒重，精密稱(chēng)定3mg，置于10mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，即得每1 mL含0.3mg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 樣品測(cè)定[3,7]精密稱(chēng)取黃芪細(xì)粉樣品5.0g，加水100mL置250mL燒瓶中，沸水浴提取3次，第一次提取時(shí)間為1h、第二次和第三次各提取0.5h，三次合并后的濾液濃縮至約10mL，配成含80%乙醇的混合溶液，4°C冰箱中靜置24 h，70%乙醇三次洗滌濾渣，60°C干燥，即得粗多糖并精密稱(chēng)重。

取適量的黃芪粗多糖樣品，加溫水溶解制備成0.13 mg/mL粗多糖供試品溶液，量取0.4 mL，加水稀釋5倍后緩慢加入4.0 mL的蒽酮-濃硫酸溶液(0.2%)，不斷震蕩中進(jìn)行10min沸水浴，反應(yīng)液用冰水冷卻至室溫，穩(wěn)定顯色0.5h后采用紫外分光光度計(jì)于625 nm處(葡聚糖最大吸收波長(zhǎng))測(cè)定吸收度，以葡聚糖對(duì)照品溶液外標(biāo)兩點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算，測(cè)定黃芪多糖含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 黃芪總皂苷的含量測(cè)定

2.3.1 配制黃芪甲苷對(duì)照品溶液 黃芪甲苷對(duì)照品精密稱(chēng)定4mg，加甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配制成0.4 mg/L的溶液，4°C冰箱保存，備用。

2.3.2 樣品測(cè)定[3,8]精密稱(chēng)取40目過(guò)篩后的黃芪粉末2.0g，加100mL甲醇在250mL圓底燒瓶中冷浸過(guò)夜，第二天冷浸液甲醇回流提取2 h，甲醇25mL洗滌濾渣3次，濃縮濾液，50mL水飽和的正丁醇?xì)堅(jiān)鼘堅(jiān)芙廪D(zhuǎn)移至100mL分液漏斗中，加氨試劑各洗滌3次，第一次洗滌液為30mL、第二次和第三次各為20mL，20mL水飽和的正丁醇洗滌合并后的氨試劑層，正丁醇層收集液60°C水浴蒸干，殘?jiān)?00mL甲醇溶解作為供試品溶液。

精密量取供試品溶液0.4mL，加入0.2mL香草醛-冰醋酸溶液(5%)和0.8mL高氯酸溶液，混合均勻，置70°C水浴中15min，冷卻。精密加入5mL冰醋酸，搖勻后在581nm處(黃芪甲苷最大吸收波長(zhǎng))測(cè)定吸光度，以黃芪甲苷對(duì)照品溶液外標(biāo)兩點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算，測(cè)得黃芪總皂苷含量(見(jiàn)表2)。

2.4 黃芪總黃酮的含量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)蘆丁對(duì)照品5mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得每1 mL含0.5mg的蘆丁對(duì)照品溶液，備用。

2.4.2 樣品測(cè)定[9,10]精密稱(chēng)取黃芪樣品2.0g(過(guò)篩40目、60°C干燥5 h)，置100mL容量瓶中，加甲醇35mL，超聲分別提取三次(時(shí)間分為30，30，5min)，濾液加甲醇定容至50mL容量瓶中，作為供試品溶液。

精密量取2.0mL供試品溶液，加水1.0mL，置小反應(yīng)瓶中，加入5% NaNO20.4 mL混合均勻，6min后加入0.4mL 10% Al(NO3)3搖勻，6min后再加4% NaOH 4 mL，后用蒸餾水定容至10mL容量瓶中，搖勻，采用紫外分光光度計(jì)于500 nm處(蘆丁最大吸收波長(zhǎng))測(cè)定吸收度，以蘆丁對(duì)照品溶液的外標(biāo)兩點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算上述黃芪樣品中有效成分總黃酮的含量(結(jié)果見(jiàn)表2)。

2.5 黃芪樣品中水分、干物質(zhì)(DM)及粗脂肪(TP)含量測(cè)定 參照《中國(guó)藥典》2010版具體項(xiàng)下要求進(jìn)行黃芪樣品的水分和干物質(zhì)(DM)含量測(cè)定。備注：黃芪樣品扣除水分后的藥材干重占樣品全部重量的比重定義為黃芪干物質(zhì)含量。結(jié)果詳見(jiàn)表2。

黃芪粗脂肪的測(cè)定方法如下：精密稱(chēng)定黃芪粉末4.0g，置烘箱中105°C干燥。取樣品適量，精密稱(chēng)定后用錫箔濾紙包裹，采用70mL石油醚(60°C～90°C)在抽提瓶中提取4 h，提取液減壓回收石油醚，殘?jiān)稍镏梁阒?，稱(chēng)重計(jì)算黃芪樣品中所含有效成分粗脂肪的含量，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6 黃芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量測(cè)定

2.6.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS2 (4.6mm×200mm，5μm)；梯度洗脫條件-流動(dòng)相：乙腈(A)：水(0～25min,17%～31%(A)；26min，35%(A)；26～45min，35%(A)；45～60min，35%～17%(A)；進(jìn)樣量20μL，流速1.0mL/min。

2.6.2 芒柄花素和毛蕊異黃酮對(duì)照品溶液的制備 分別稱(chēng)取芒柄花素及毛蕊異黃酮對(duì)照品適量，精密成定后加甲醇制備成相應(yīng)溶度的對(duì)照品溶液，4°C冰箱保存，備用。

2.6.3 樣品測(cè)定[10-12]精密稱(chēng)取黃芪樣品0.5g(過(guò)篩40目、60°C干燥5 h)，置100mL圓底燒瓶中，加80%甲醇30mL，3次回流提取，每次提取時(shí)間均為1h，濾液合并后回收甲醇試劑，所得殘?jiān)状既芙狻⒍ㄈ?，作為供試品溶液。?.6.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定芒柄花素和毛蕊異黃酮成分的含量(詳見(jiàn)色譜圖2)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黃芪藥材(10批)中有效成分的含量測(cè)定結(jié)果

注：IS1(X1)：毛蕊異黃酮；IS2(X2)：芒柄花素；TIS(X3)：總黃酮；AS1(X4)：黃芪甲苷；TAS(X5)：總皂苷；CF(X6)：粗脂肪；TP(X7)：總多糖；DM(X8)：干物質(zhì)。

1.毛蕊異黃酮；2.為芒柄花素

3 結(jié)果與分析

3.1 黃芪藥材有效化學(xué)成分含量結(jié)果分析

由表2可知，10批黃芪藥材中有效(活性)成分芒柄花素、粗脂肪、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮以及總多糖含量存在較大的差異。黃芪藥材NO.1～NO.10中芒柄花素含量為33.98～238(77.9±62.9)μg/g，粗脂肪含量為9.9～5.1(15.1±4.9)mg/g，黃芪甲苷含量為539～2156(1500±650)μg/g，毛蕊異黃酮含量為109.2～791.6(437.5±243.5)μg/g，總多糖含量為0.78～10.28(5.67±3.14)%等。由上述10批次黃芪樣品8種有效成分的含量測(cè)定結(jié)果分析，我們發(fā)現(xiàn)上述所有樣品中山西渾源下韓鄉(xiāng)野生黃芪藥材整體上含有較高芒柄花素、粗脂肪、黃芪甲苷、總多糖以及干物質(zhì)等有效成分；陜西野生黃芪樣品的總黃酮含量則相對(duì)較高，廣靈栽培黃芪樣品整體總皂苷和毛蕊異黃酮兩種成分含量較高，而渾源縣下韓鄉(xiāng)栽培黃芪具有含量較高的總多糖成分，相反整體而言四川以及黑龍江(膜莢)兩地黃芪藥材中的上述8種成分均具有較低的含量。

綜上所述，山西為黃芪的道地產(chǎn)區(qū)，適宜的海拔、水文氣候和土壤中豐富的礦物元素使渾源縣下韓鄉(xiāng)黃芪樣品(野生和人工栽培)整體上具有較高含量的有效成分；四川和黑龍江地區(qū)可能不太適宜黃芪中有效成分的積累，以致各有效成分含量整體水平較低。

3.2 10批次不同產(chǎn)地黃芪藥材的質(zhì)量評(píng)估與內(nèi)在8種有效成分之間相關(guān)性分析

3.2.1 黃芪藥材中有效成分之間PCA相關(guān)性分析 采用主成分分析(PCA)方法對(duì)上述10個(gè)批次黃芪(不同產(chǎn)地來(lái)源和年限)，可能影響黃芪藥材內(nèi)在質(zhì)量的總成分和單一成分共8種主要有效成分進(jìn)行主成分分析，以各成分的特征值和貢獻(xiàn)率(方差百分比)及累計(jì)貢獻(xiàn)率進(jìn)行綜合評(píng)估。結(jié)果表明，第一主成分的特征貢獻(xiàn)率為39.7%，主要有效成分為黃芪甲苷(X4)、總多糖(X7)、粗脂肪(X6)、干物質(zhì)(X8)；第二主成分的總黃酮(X3)、總皂苷(X5)、毛蕊異黃酮(X1)為主要有效化學(xué)成分，整體特征貢獻(xiàn)率為28.1%；第三主成分的主要有效成分為總多糖(X7)，整體特征貢獻(xiàn)率為12.6%。

3.2.1.2 10個(gè)批次不同產(chǎn)地和年限黃芪樣品的聚類(lèi)分析

圖3 10批黃芪藥材聚類(lèi)Score圖

鑒于第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的累積貢獻(xiàn)率為67.8%(3.2.1項(xiàng)下計(jì)算)，采用PCA分析軟件(SIMCA-P 11.5版本)在第一主成分和第二主成分綜合效益分析基礎(chǔ)上對(duì)上述不同產(chǎn)地來(lái)源和年限的10批次黃芪樣品進(jìn)行生物生態(tài)學(xué)的聚類(lèi)分析，結(jié)果詳見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，10批黃芪樣品(No.1～No.10)共聚類(lèi)分為三個(gè)分布組別，即聚類(lèi)組別A～C(group A，B，C)。group A主要由山西渾源縣下韓鄉(xiāng)地區(qū)的6個(gè)野生與栽培黃芪樣品組成，group B則有2個(gè)山西廣靈栽培黃芪和陜西野生組成；相反，兩個(gè)地域邊緣化的四川理縣黃芪和黑龍江(膜莢)樣品組成group C。

3.2.2 黃芪藥材中有效(活性)成分之間的關(guān)聯(lián)性分析 本文采用SPSS11.5軟件來(lái)分析黃芪有效化學(xué)成分含量之間的相互關(guān)聯(lián)性，具體分析結(jié)果如下：①黃芪藥材中有效化學(xué)成分毛蕊異黃酮含量(X1)與另一種有效成分總黃酮含量(X3)具有非常顯著的正向相關(guān)性，擬合的相關(guān)方程和相關(guān)系數(shù)為X1=-1034+720.5X3(r=0.816，P=0.003)；②黃芪藥材中有效化學(xué)成分芒柄花素含量(X2)與另一種有效成分粗脂肪含量(X6)同樣具有顯著正向相關(guān)性，擬合的相關(guān)方程及相關(guān)系數(shù)為X2=192.8-1.68(X6)2+0.0678(X6)3(r=0.961,P=0.0475)；③黃芪藥材中法定的有效成分黃芪甲苷含量(X4)則與另一種有效化學(xué)成分總多糖含量(X7)具有非常顯著正向相關(guān)性，擬合的相關(guān)方程及相關(guān)系數(shù)為X4=473+181X7(r=0.878，P=0.001)。

綜上所述，我們可以采用黃芪藥材內(nèi)在的有效成分黃芪甲苷、毛蕊異黃酮以及芒柄花素的含量多少，一定程度上可以間接、客觀地分別反映出黃芪樣品中總多糖、總黃酮和粗脂肪的含量高低，不僅可以簡(jiǎn)化了黃芪樣品質(zhì)量測(cè)定的項(xiàng)目，同時(shí)有望發(fā)展成為一種新的思路用于黃芪藥材質(zhì)控，當(dāng)然該思路和方法還需要更為廣泛的樣品量和實(shí)踐中加以系數(shù)修訂和完善。

4 結(jié)論與討論

4.1 黃芪藥材有效(活性)成分的主成分分析 本文對(duì)可能影響10批不同產(chǎn)地來(lái)源和生長(zhǎng)年限的黃芪藥材內(nèi)在質(zhì)量的8個(gè)主要有效成分指標(biāo)進(jìn)行了PCA主成分聚類(lèi)和貢獻(xiàn)分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪樣品中4種有效化學(xué)成分黃芪甲苷、總多糖、粗脂肪、干物質(zhì)具有較大的貢獻(xiàn)，為可能影響黃芪內(nèi)在質(zhì)量評(píng)估的主要指標(biāo)，其次指標(biāo)為總皂苷、毛蕊異黃酮、總黃酮，次之則為芒柄花素成分指標(biāo)。

4.2 黃芪藥材樣品間及各指標(biāo)成分聚類(lèi)分析 綜合圖3以及主成分PC1特征貢獻(xiàn)率為39.7%，是分析的主要方面，結(jié)合聚類(lèi)分析結(jié)果，可以明顯地用于區(qū)分山西渾源樣品和其他產(chǎn)地黃芪樣品，結(jié)合上述8種有效化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果，本文大致可以得出以下結(jié)論：道地產(chǎn)區(qū)山西渾源縣下韓鄉(xiāng)野生黃芪內(nèi)在整體有效化學(xué)成分含量最高，質(zhì)量最好；道地產(chǎn)區(qū)山西渾源縣下韓鄉(xiāng)人工栽培黃芪樣品的整體有效成分含量次之，質(zhì)量相對(duì)較好；距離道地產(chǎn)區(qū)區(qū)域較近的山西廣靈人工栽培黃芪樣品與陜西野生黃芪樣品的有效成分整體也較道地產(chǎn)區(qū)渾源縣樣品低，質(zhì)量相比較渾源樣品差；相反，區(qū)域相對(duì)邊緣化且不為道地產(chǎn)區(qū)的四川理縣地區(qū)和黑龍江(膜莢)黃芪的有效成分整體含量最低，質(zhì)量也最差。

4.3 黃芪樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)的成分相關(guān)性探索 在對(duì)上述不同產(chǎn)地來(lái)源和年限的10批黃芪樣品中8個(gè)主要有效成分之間含量相互關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明，黃芪甲苷與總多糖、毛蕊異黃酮與總黃酮、芒柄花素與粗脂肪成分之間分別存在顯著的正向相關(guān)性。綜上所述，本文通過(guò)上述研究結(jié)果，一定程度上可以支持在黃芪多指標(biāo)評(píng)價(jià)和質(zhì)量研究時(shí)可以簡(jiǎn)化某些具體的檢測(cè)項(xiàng)目，可以嘗試采用一種有效成分的含量高低間接、客觀地反映出另一種有效成分的含量多少，試圖探索出黃芪質(zhì)控的新思路(“一測(cè)多評(píng)”)，進(jìn)而全面反映出黃芪藥材內(nèi)在質(zhì)量的同時(shí)最大程度的節(jié)約資源。但該項(xiàng)研究還任重而道遠(yuǎn)，需要業(yè)內(nèi)同仁們的共同努力，以便最終完善和相互修訂。

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