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(1.中藥固體制劑國(guó)家工程研究中心 江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330006)

蝦青素(Astaxanthin,3，3'-二羥基4,4'-二酮基-β，β'-胡蘿卜素)是一種類胡蘿卜素衍生物，呈鮮紅色，具有很強(qiáng)的抑制腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)，抗氧化，抵御紫外線，增強(qiáng)人體免疫功能，改善視力、色素形成和神經(jīng)連通以及改善生育等作用，特別是抗氧化作用超強(qiáng)，被譽(yù)為“超級(jí)抗氧化劑”[1-3]，因此在化妝品、保健品和醫(yī)藥中具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，蝦青素的檢測(cè)方法有薄層色譜法、分光光度法[4]、高效液相色譜法[5-7]。傳統(tǒng)的分光光度法只能測(cè)定總蝦青素類酯的含量。采用皂化的方法可將不同的蝦青素類酯完全皂化成游離蝦青素，并采用高效液相色譜法可以解決這個(gè)問(wèn)題。本文采用高效液相色譜法，建立了皂化后游離蝦青素含量測(cè)定的方法，考察了不同皂化時(shí)間、皂化溶劑和皂化時(shí)堿濃度對(duì)游離蝦青素的影響，并測(cè)定了不同蝦青素提取物中游離蝦青素的含量。

1 儀器與材料

Waters高效液相色譜儀(Waters 2695分離單元，Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站)；Millipore-Q純水器(美國(guó)Millipore公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；超聲波清洗儀：KQ3200(昆山市超聲儀器有限公司)。蝦青素對(duì)照品(Dr. Ehrenstorfer Gmbh，批號(hào)：CA10307000純度：97.1%)、粉狀蝦青素提取物1(Cyanotech公司)、粉狀蝦青素提取物2(飼料級(jí))、油狀蝦青素提取物(Cyanotech公司)、普麗普萊紅球藻提取物(蝦青素)軟膠囊(PURITAN'S PRIDE,INC.Holbrook,NY 11741 U.S.A.)、金奧力蝦青素壓片糖果(威海紫光生物科技開(kāi)發(fā)有限公司)，甲醇為色譜純，氯仿、無(wú)水乙醇、二氯甲烷、氫氧化鉀為分析純，水為超純水，BHT。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：色譜柱為Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(95∶5)；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：475nm；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：室溫。

2.2 測(cè)定方法

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蝦青素對(duì)照品4.01mg，置50mL量瓶中，用少量二氯甲烷(1mL)振搖使溶解，用甲醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取此儲(chǔ)備液2mL置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取8mg樣品，精密稱定，加5mL溶劑(二氯甲烷：甲醇=1∶3)，再加入3mL體積的1%KOH甲醇溶液，超聲15min，用溶劑定容至10mL。置黑暗環(huán)境下，4℃冰箱中皂化7 h左右，皂化后的蝦青素提取液過(guò)0.45μm膜作為供試品溶液。

分別取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各10μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算蝦青素的含量，色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 蝦青素對(duì)照品溶液

圖2 粉狀蝦青素提取物1(Cyanotech公司)

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，進(jìn)樣5，10，15，20，25，30μL，以峰面積(Y)對(duì)對(duì)照品量(X)進(jìn)行線性回歸處理，線性方程為：Y=53774X-7242.3，r=0.9993，結(jié)果表明在0.0802～0.4812/μg內(nèi)進(jìn)樣體積與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度 精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定蝦青素的峰面積，峰面積的RSD分別為0.93%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取蝦青素提取液，照2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品5份，照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為107.6μg/mL，RSD為1.09%。

2.6 回收率試驗(yàn) 取蝦青素供試品溶液5份，分別加入2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液4mL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果(n=5)

2.7 不同蝦青素提取物的含量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)比較了本文建立的方法和紫外分光光度法[8]兩者的分析結(jié)果，結(jié)果如表2。結(jié)果表明，紫外分光光度法并不能準(zhǔn)確的檢測(cè)物質(zhì)中游離蝦青素的質(zhì)量濃度，游離蝦青素的最大吸收波長(zhǎng)在476nm附近，蝦青素酯在476nm波長(zhǎng)處也存在吸收，其所測(cè)是游離蝦青素與蝦青素類酯的總和[7]。而本文建立的方法，皂化后蝦青素類酯能很好的轉(zhuǎn)化為游離蝦青素，能通過(guò)高效液相法較為準(zhǔn)確的測(cè)出其游離蝦青素的含量。

表2 不同蝦青素產(chǎn)品中蝦青素測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 經(jīng)波長(zhǎng)掃描，蝦青素在本流動(dòng)相中的最大吸收波長(zhǎng)為475nm，故選擇475為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 皂化條件考察

3.2.1 皂化溶劑的影響 考察了甲醇、二氯甲烷、丙酮、二氯甲烷-甲醇(1∶3)、丙酮-甲醇(3∶1)作為皂化溶劑對(duì)蝦青素類酯皂化效率的影響。結(jié)果表明，使用不同皂化溶劑皂化后蝦青素的含量分別為：甲醇為0.56%，二氯甲烷為0.71%，丙酮為0.48%，二氯甲烷-甲醇為1.32%，丙酮-甲醇為0.89%。因此確定皂化溶劑為二氯甲烷-甲醇(1∶3)。

3.2.2 堿濃度的影響 不同濃度的KOH甲醇溶液影響蝦青素的皂化效率。當(dāng)濃度低時(shí)皂化不完全，濃度過(guò)高又會(huì)導(dǎo)致蝦青素氧化，并破壞蝦青素而使得皂化效率降低。本文考察了0.1%、0.5%、1%、2%和3%不同濃度的KOH甲醇溶液的皂化效率。結(jié)果表明，當(dāng)KOH甲醇溶液的濃度為1%時(shí)，能取得較好的皂化效率。其蝦青素的含量分別為：0.1%KOH甲醇為0.44%，0.5%KOH甲醇為1.26%，1%KOH甲醇為1.36%，2%KOH甲醇為0.46%，3%KOH甲醇為0.076%。因此確定KOH甲醇的濃度為1%。

3.2.3 皂化時(shí)間的影響 在確定了上述皂化條件后，對(duì)不同的皂化時(shí)間進(jìn)行考察，分別考察了皂化1，3，5，7，9，11，13h和15h，結(jié)果表明，皂化時(shí)間為7h時(shí)，蝦青素的含量最大。其蝦青素的含量分別為：1h為0.52%，3h為0.91%，5h為1.10%，7h為1.36%，9h為1.35%，11h為1.32%，13h為1.11%，15h為1.05%。因此確定皂化時(shí)間為7h。

4 結(jié)論

本文建立了KOH皂化不同蝦青素提取物中蝦青素類脂，高效液相色譜紫外檢測(cè)游離蝦青素含量的方法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠，可用于蝦青素的含量測(cè)定；優(yōu)化了皂化條件，使得皂化更加方便、簡(jiǎn)單、快捷；分析比較了紫外分光光度法和高效液相法測(cè)定不同蝦青素提取物中蝦青素的含量，結(jié)果表明，紫外分光光度法不能準(zhǔn)確測(cè)定游離蝦青素的含量。

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