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(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院骨科，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis， OA)關(guān)節(jié)軟骨中間充質(zhì)祖細(xì)胞(mesenchymal progenitor cells，MPCs)數(shù)量?jī)H占其關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)量的3%～4%，雖然OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs比正常人增殖活躍，但其成軟骨、成骨分化能力較低。如何利用有效基因過表達(dá)，調(diào)控原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs的增殖和成軟骨分化作用，恢復(fù)OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞調(diào)節(jié)和維持軟骨組織損傷與修復(fù)的動(dòng)態(tài)平衡，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用前景。在體外培養(yǎng)中添加細(xì)胞因子易流失，且細(xì)胞因子價(jià)格昂貴，因此結(jié)合應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將具有促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨MPCs增殖和成軟骨分化的目的基因?qū)肫渲?，在?xì)胞中高表達(dá)促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨MPCs的增殖和分化，修復(fù)退變和損傷的軟骨，無疑具有重要的作用。目前對(duì)SOX家族促軟骨分化作用研究，國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，用SOX6、SOX9基因感染原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨的MPCs，誘導(dǎo)其成軟骨分化，比較SOX6、SOX9基因感染和未感染組細(xì)胞的成軟骨分化能力的變化。進(jìn)一步探討基因治療在關(guān)節(jié)軟骨退變中應(yīng)用的可行性，為臨床治療軟骨退變和軟骨損傷提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采用免疫磁珠方法分選得到原發(fā)性O(shè)A及正常人關(guān)節(jié)軟骨MPCs。SOX6、SOX9基因轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑：脂質(zhì)體( 美國(guó)lipofectAMINE 2000 )、Ⅱ 型膠原多克隆抗體(美國(guó)santa cruze) Pme I,Pac I內(nèi)切酶(英國(guó) NEB)、Xho I，Sal I，T4連接酶及T載體(大連寶生物公司)、腺病毒載體。主要儀器設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)、RT-PCR檢測(cè)儀器設(shè)備。

1.2 方法

1.2.1 SOX6、SOX9基因的構(gòu)建 細(xì)胞及細(xì)胞株(人胚腎FT-293細(xì)胞)購(gòu)自invitriogen公司。pAdTrack-CMV-SOX6，SOX9的構(gòu)建。pAdtrack-CMV-SOX6，SOX9穿梭質(zhì)粒的鑒定。使用Sal I、Xho I雙酶切后，凝膠電泳鑒定應(yīng)見到576bp片段為SOX6，SOX9，9.2kb片段為pAdtrack-CMV載體片段。pAdEasy-SOX6，SOX9重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定。pAdEasy-SOX6，SOX9重組腺病毒基因組質(zhì)粒的鑒定。

1.2.2 pAdEasy-SOX6，SOX9重組腺病毒的包裝、篩選及鑒定 本實(shí)驗(yàn)中腺病毒載體是一種復(fù)制缺陷病毒，不能自行包裝成為具有感染能力的病毒顆粒，因此我們必須在293包裝細(xì)胞中進(jìn)行包裝。本試驗(yàn)所采用的293細(xì)胞是由Invitrogen公司提供的FT-293細(xì)胞，與普通的293細(xì)胞相比，具有較強(qiáng)的黏附能力和空斑形成能力。均成功包裝為有感染能力的腺病毒。

1.2.3 病毒純化 以CsCl2方法純化病毒，并進(jìn)行滴度測(cè)定。通過RFP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定。滴度=IU×計(jì)量孔相對(duì)于第一孔的稀釋倍數(shù)/第一孔加入病毒體積。

1.2.4 SOX6、SOX9基因感染原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs 以不同滴度(1×104，2×104，3×104，4×104，5×104)病毒感染細(xì)胞，24 h后觀察感染效率，確定最佳感染濃度。

1.2.5 基因感染原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs的成軟骨分化 進(jìn)行基因感染及未感染細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡下觀察比較基因轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染組OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs的形態(tài)變化和生長(zhǎng)情況，觀察周期14 d。基因轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞成軟骨分化檢測(cè)指標(biāo)包括：①TB染色；②Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)(方法同前)；③Ⅱ型膠原mRNA定量RT-PCR檢測(cè)。成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周，取6孔板中的細(xì)胞，用定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)。操作方法同Ⅱ型膠原基因mRNA檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SOX6、SOX9基因的構(gòu)建、鑒定及純化

2.1.1 pAdTrack-CMV-SOX6，SOX9腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建 成功獲得SOX6，SOX9基因克隆，經(jīng)過PCR檢測(cè)，該基因克隆證實(shí)與Genebank報(bào)道序列一致(見圖1)。圖1結(jié)果顯示，SOX基因克隆左為SOX6，條帶為2 500bp左右，右為SOX9，條帶為1 750bp左右。(Marker為DL2000，由上至下依次為2 000,1 000,750,500,250,100 bp)。pAdTrack-CMV-SOX6，SOX9雙酶切鑒定(見圖2)。圖2結(jié)果顯示，T-SOX6，SOX9和pAdTrack-CMV雙酶切獲得SOX6，SOX9目的片段和病毒載體骨架質(zhì)粒pcDNA3.1-SOX6，SOX9重組載體經(jīng)Sal I、Xho I雙酶切，凝膠電泳后，紫外透射反射檢測(cè)儀上可觀察到預(yù)期大小的目的片段(SOX6約2 500bp，SOX9約1 800bp)。經(jīng)Sal I、Xho I雙酶切后pAdTrack-CMV同樣可以釋放出同樣大小目的片段，與預(yù)期的結(jié)果相符。重組pAdEasy-SOX6，SOX9經(jīng)Pac I酶切可見23 kb SOX6和4.0 kb SOX9片段。

圖1 PCR檢測(cè)SOX6，SOX9基因克隆

a：pAdTrack-CMV釋放出預(yù)期大小目的片段;b：pAdEasy-SOX6，SOX9經(jīng)Pac I酶切可見23 kb和4.0 kb左右片段

圖2SOX6、SOX9雙酶切鑒定

2.1.2 病毒包裝、純化與滴度測(cè)定 脂質(zhì)體包裹pAdEasy-SOX6，SOX9同源重組腺病毒基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT包裝細(xì)胞10 d后，光鏡下觀察到空斑形成，細(xì)胞變圓、腫脹、脫壁，細(xì)胞核變大等病變。綠色熒光的表達(dá)情況顯示，熒光顯微鏡下觀察，在綠色熒光激發(fā)通道GFP受激發(fā)，表達(dá)GFP基因的細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光(見圖3)。重組腺病毒感染的293細(xì)胞，在培養(yǎng)2～3 d后有綠色熒光表達(dá)，并且逐漸增多，熒光表達(dá)逐步增強(qiáng)。Ad-SOX6，SOX9重組腺病毒經(jīng)293FT細(xì)胞5輪擴(kuò)增提高滴度，之后大量擴(kuò)增，采用倍比稀釋法測(cè)定腺病毒滴度為5×1010PFU/mL。

a:pAdEasy-SOX6,同源重組腺病毒基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染健康293包裝細(xì)胞收獲病毒，再次感染293FT細(xì)胞;b:pAdEasy-SOX9,同源重組腺病毒基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染健康293FT包裝細(xì)胞收獲病毒，再次感染293FT細(xì)胞

圖3pAdEasy-SOX9綠色熒光的表達(dá)情況(×100)

2.2 SOX6、SOX9基因能有效感染OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs細(xì)胞

結(jié)果顯示，接種5×103MPCs細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)1 d后加入不同滴度病毒液SOX6或SOX9病毒液感染細(xì)胞，24 h后觀察顯示兩種基因包裝病毒在2×104滴度時(shí)對(duì)MPCs細(xì)胞具有良好的侵襲性，感染效率近100%，且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好(1×104滴度時(shí)感染效率僅60%，3×104～5×104滴度時(shí)有部分細(xì)胞死亡)，見圖4。

a:同視野普通光鏡;b:同視野熒光;c:同視野普通光鏡;d:同視野熒光

圖4SOX6及SOX9對(duì)MPCs的感染(×200)

2.3 SOX6、SOX9基因感染的原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨 MPCs成軟骨分化潛能

2.3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 基因感染組細(xì)胞經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，可見明顯的細(xì)胞聚集生長(zhǎng)、基質(zhì)分泌，高密度接種處可形成多個(gè)結(jié)節(jié)，并逐漸增大；未感染組細(xì)胞聚集培養(yǎng)后形成結(jié)節(jié)數(shù)量少，結(jié)節(jié)形態(tài)小，分泌基質(zhì)少，見圖5。

2.3.2 TB染色 SOX9基因感染組軟骨誘導(dǎo)分化的“微團(tuán)”結(jié)節(jié)培養(yǎng)14 d，其TB染色深濃；SOX6基因感染組成軟骨誘導(dǎo)分化“微團(tuán)”結(jié)節(jié)培養(yǎng)14 d，TB染色也呈深染，但弱于SOX9；未感染組成軟骨誘導(dǎo)分化“微團(tuán)”結(jié)節(jié)培養(yǎng)14 d，TB染色淺淡(見圖6)。

2.3.3 Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色 SOX9基因感染組成軟骨誘導(dǎo)分化的“微團(tuán)”結(jié)節(jié)培養(yǎng)14 d，Ⅱ型膠原呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖7a)；SOX6基因感染組成軟骨誘導(dǎo)分化“微團(tuán)”結(jié)節(jié)培養(yǎng)14 d，Ⅱ型膠原呈陽(yáng)性表達(dá)(圖7b)；未感染組成軟骨誘導(dǎo)分化“微團(tuán)”結(jié)節(jié)培養(yǎng)14 d，Ⅱ型膠原表達(dá)呈弱陽(yáng)性(圖7c)。

2.3.4 Ⅱ型膠原mRNA表達(dá) 圖8結(jié)果顯示，SOX6能增強(qiáng)Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)，是未感染組的3.8倍(P<0.05)。SOX9基因?qū)Β蛐湍z原mRNA的表達(dá)具有更強(qiáng)的促進(jìn)作用，感染組是未感染組的5.15倍(P<0.01)。

a:SOX9感染組;b:SOX6感染組;c:未感染組

a：SOX9感染組;b:SOX6感染組;c:未感染組

a：SOX9感染組;b:SOX6感染組;c:未感染組

圖8 SOX6、SOX9基因感染組和未感染組Ⅱ型膠原mRNA基因表達(dá)變化

3 討論

SOX基因家族是控制發(fā)育的一類新的以SRY基因?yàn)榇淼幕蚣易錥1]。這類基因功能的實(shí)現(xiàn)依賴于一個(gè)DNA的結(jié)合基序列稱為HMG2box編碼的產(chǎn)物[2-3]。SOX9在軟骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮非常必要的作用，其對(duì)于建立軟骨生長(zhǎng)板及促進(jìn)正常的軟骨內(nèi)成骨和及時(shí)發(fā)育都是必需的，并且SOX9與SOX6共同表達(dá)于所有分化的軟骨細(xì)胞和軟骨前細(xì)胞[4]。SOX9主要參與對(duì)軟骨細(xì)胞分化進(jìn)行調(diào)節(jié)的過程，而對(duì)于正常狀態(tài)關(guān)節(jié)軟骨的代謝變化與Ⅱ型膠原的表達(dá)沒有增強(qiáng)效應(yīng)[5]。既往文獻(xiàn)報(bào)道SOX9參與調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的成熟過程，但其對(duì)軟骨細(xì)胞的具體作用，離體培養(yǎng)細(xì)胞環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境存在的差異等問題有待進(jìn)一步研究[6]。SOX9基因作用于軟骨細(xì)胞的分化階段，SOX9在退變的軟骨細(xì)胞中表達(dá)明顯增多，該基因參與軟骨退變和OA軟骨細(xì)胞的分化與調(diào)控過程[7]。Yang等[8]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了通過纖維蛋白凝膠封裝或轉(zhuǎn)染SOX基因(SOX5, 6, 9)的移植間充質(zhì)干細(xì)胞能夠成功分化為成熟的軟骨細(xì)胞并用于重建透明關(guān)節(jié)軟骨。Kim等[9]通過實(shí)驗(yàn)指出，SOX基因(SOX5, 6, 9)在人類間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)明顯低于軟骨細(xì)胞。電穿孔介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染SOX基因(SOX5, 6, 9)能夠增強(qiáng)人類間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨形成并抑制人類間充質(zhì)干細(xì)胞的肥大。SOX9基因轉(zhuǎn)染能夠改善軟骨形成[10]，SOX9基因功能的缺失會(huì)導(dǎo)致體外鼠胚胎干細(xì)胞軟骨分化的缺陷[11]。SOX5, SOX6和SOX9的結(jié)合能夠?yàn)橛谰眯攒浌堑恼T導(dǎo)提供足夠信號(hào)[12]。轉(zhuǎn)錄因子SOX9在軟骨分化過程中發(fā)揮重要作用， SOX5、SOX6的基因表達(dá)需要SOX9[13]。轉(zhuǎn)錄因子SOX9在軟骨形成過程中發(fā)揮重要作用，但是在軟骨內(nèi)骨化的晚期起抑制作用。單獨(dú)SOX9基因或SOX9基因與SOX5、SOX6基因過度表達(dá)都會(huì)抑制小鼠初級(jí)軟骨細(xì)胞的成熟與鈣化[14]。SOX6和SOX9對(duì)成軟骨分化的調(diào)控作用非常復(fù)雜，存在的爭(zhēng)議也較多[15-16]。諸多因素如細(xì)胞培養(yǎng)條件、細(xì)胞的增殖狀態(tài)等均會(huì)影響SOX基因?qū)SCs成軟骨分化的調(diào)節(jié)作用，尤其是細(xì)胞的分化狀態(tài)對(duì)SOX9作用的影響更為巨大,有關(guān)的確切機(jī)制尚不明，考慮可能與以下因素有關(guān)：①細(xì)胞因子刺激后信號(hào)傳遞途徑的改變及細(xì)胞表面受體表達(dá)的改變；②周圍細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生變化影響膠原合成效應(yīng)。SOX9調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的確切分子機(jī)制還不是很清楚，只有確定了它們作用的靶基因，研究才能進(jìn)一步突破[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)觀察了SOX6、SOX9基因轉(zhuǎn)染的OA關(guān)節(jié)軟骨中的MPCs的成軟骨分化過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX6、SOX9基因轉(zhuǎn)染的OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs細(xì)胞經(jīng)微球培養(yǎng)后可見明顯的細(xì)胞聚集現(xiàn)象，形成大量的乳白色類軟骨樣結(jié)節(jié)；未轉(zhuǎn)染組形成結(jié)節(jié)數(shù)量少，形態(tài)小，分泌基質(zhì)少。OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞成軟骨分化誘導(dǎo)后TB染色顯示Ⅱ型膠原染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，未轉(zhuǎn)染組僅為陽(yáng)性著色；Ⅱ型膠原定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX6基因轉(zhuǎn)染OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs細(xì)胞，在成軟骨分化過程中，能顯著增強(qiáng)Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)，是未轉(zhuǎn)染組的3.8倍；SOX9基因?qū)Β蛐湍z原mRNA的表達(dá)具有更強(qiáng)的促進(jìn)作用，轉(zhuǎn)染組是未轉(zhuǎn)染組的5.15倍，說明SOX6、SOX9轉(zhuǎn)染OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs能顯著促進(jìn)OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs成軟骨分化并合成關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原，促進(jìn)軟骨退變和損傷的修復(fù)。Lee等[19]通過實(shí)驗(yàn)指出，脂肪干細(xì)胞與SOX基因(SOX5, SOX6, SOX9)共轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠明顯促進(jìn)骨軟骨缺損模型的在體軟骨愈合并且能夠阻止手術(shù)誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎的退行性變。Kim等[20]通過實(shí)驗(yàn)指出，髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎與SOX9啟動(dòng)子表觀遺傳學(xué)的改變有關(guān)，包括DNA的甲基化及組蛋白修飾的改變。Lee等[21]通過實(shí)驗(yàn)指出，SOX基因(SOX5, 6, 9)及蛋白隨著人類關(guān)節(jié)軟骨骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展而減少。Haag等[22]通過人體標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)研究指出，SOX6與SOX9在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的下降是骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)定性丟失的原因。本研究為臨床上進(jìn)行MPCs基因轉(zhuǎn)染，促進(jìn)其增殖和分化，體外擴(kuò)增修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷提供新的治療方法。

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