游洪燕,楊 哲,肖安風(fēng),2,3,4 ,倪 輝,2,3,4,蔡慧農(nóng),2,3,4,楊秋明,2,3,4

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院,福建 廈門361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361021;3.福建省高校食品微生物與酶工程技術(shù)研究中心,福建 廈門361021;4.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心,福建 廈門361021)

促進(jìn)劑對(duì)枯草芽胞桿菌CICC20958產(chǎn)肌苷的影響

游洪燕1，2,楊 哲1,肖安風(fēng)1,2,3,4,倪 輝1,2,3,4,蔡慧農(nóng)1,2,3,4,楊秋明1,2,3,4

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院,福建 廈門361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361021;3.福建省高校食品微生物與酶工程技術(shù)研究中心,福建 廈門361021;4.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心,福建 廈門361021)

根據(jù)肌苷的代謝調(diào)控機(jī)理，選擇檸檬酸鈉、NaF、CaCl2、次黃嘌呤、MnSO45種肌苷促進(jìn)劑，考察它們的不同添加量對(duì)枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis,簡(jiǎn)稱Bs)CICC20958菌株產(chǎn)肌苷的影響，采用均勻設(shè)計(jì)法得到最佳組合添加方案.結(jié)果表明，在促進(jìn)劑檸檬酸鈉、NaF、CaCl2、次黃嘌呤、MnSO4質(zhì)量濃度分別為7.9、0.001、0.032、2.1、0.2 g/L的條件下發(fā)酵，菌株Bs CICC20958的肌苷產(chǎn)量達(dá)到7.81 g/L，比不添加促進(jìn)劑實(shí)驗(yàn)組(對(duì)照組)的肌苷產(chǎn)量提高了5.38倍.

枯草芽胞桿菌；CICC20958；肌苷；促進(jìn)劑；均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

0 引言

肌苷(Inosine)又名次黃嘌呤核苷，它是食品增鮮劑5′-肌苷酸鈉、呈味核苷酸二鈉的主要原料之一[1]，它在臨床上被廣泛用于心臟病、肝病、白血球減少癥、血小板減少癥等疾病的治療[2-4].枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis,簡(jiǎn)稱Bs)主要通過(guò)糖酵解途徑(EMP途徑)和戊糖磷酸途徑(HMP途徑)進(jìn)行分解代謝，提高葡萄糖代謝途徑中關(guān)鍵酶的活力以促進(jìn)肌苷的合成.郭元昕等[5]在培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的葡萄糖酸鈣，使肌苷產(chǎn)量達(dá)到18.36 g/L，比不添加時(shí)提高70%.劉新星等[6]在發(fā)酵的基礎(chǔ)料中添加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的檸檬酸鈉，發(fā)現(xiàn)檸檬酸鈉的添加降低了EMP途徑中的6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活力，使肌苷產(chǎn)量提高18%，肌苷對(duì)葡萄糖得率增加38%.Wu等[7]證明了在搖瓶培養(yǎng)基中加入0.2 ～0.5 g/L的檸檬酸可以顯著提高D-核糖產(chǎn)量，并在7 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了放大驗(yàn)證.此外，在肌苷生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的前體物次黃嘌呤，使嘌呤堿基通過(guò)補(bǔ)救途徑直接合成核苷，從而也可以增加肌苷的生成量[8-10].Mn2+[11]、酵母粉[12]、MnSO4[13]、Na2MoO4[13]、CoCl2[13]等添加物同樣可促進(jìn)肌苷的產(chǎn)量.本文選取了檸檬酸鈉、CaCl2、NaF、次黃嘌呤、MnSO45種促進(jìn)劑添加到產(chǎn)肌苷的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在單因素的基礎(chǔ)上，再采用均勻設(shè)計(jì)方法優(yōu)化促進(jìn)劑組合添加的方案，探究這5種促進(jìn)劑對(duì)Bs CICC20958產(chǎn)肌苷代謝過(guò)程中某些關(guān)鍵酶的影響，以及其如何促進(jìn)肌苷產(chǎn)量.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、CaCO3、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉等分析純?cè)噭┚?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；酵母膏購(gòu)于上海華美生物公司；玉米漿(含47.5%干物質(zhì))由廈門匯盛生物有限公司提供；肌苷標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；甲醇(色譜純) 購(gòu)于美國(guó)天地公司.

1.2 培養(yǎng)基成分

1)斜面培養(yǎng)基(g/L) ：葡萄糖5，蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉2.5，瓊脂20，pH=7.2，0.1 MPa滅菌15 min.

2)種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏15，玉米漿12，氯化鈉2.5，尿素2，pH=7.2，0.1 MPa滅菌15 min.

3)初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖150，酵母膏10，玉米漿12，尿素6，MgSO41，KH2PO32.5，氯化鉀1，pH=7.0，0.1 MPa滅菌15 min.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1) 菌種培養(yǎng)方法 將保藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基，在37 ℃下活化18 h.從斜面取一環(huán)菌種，接種于含25 mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在34 ℃、220 r/min下培養(yǎng)18 h.將培養(yǎng)好的種子液按5%的接種量加入到含25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，34 ℃、280 r/min發(fā)酵72 h.

2) 生物量檢測(cè) 從搖瓶中均勻吸取0.1 mL發(fā)酵液，用蒸餾水梯度稀釋至80倍，在660 nm的波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值.

3)肌苷產(chǎn)量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[14].從搖瓶中均勻吸取發(fā)酵液，離心后吸取上清液，用去離子水梯度稀釋50倍.稀釋后的樣品用0.22 μm膜過(guò)濾后，高效液相色譜法測(cè)肌苷濃度.

色譜條件為：Symmetry型C18反相柱(柱徑4.6 mm×150 mm)，流動(dòng)相為水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%磷酸)和甲醇，流速0.6 mL/min，波長(zhǎng)248 nm，梯度洗脫.

4)菌株Bs CICC20958均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，分別設(shè)檸檬酸鈉、NaF、CaCl2、次黃嘌呤、MnSO45個(gè)因素為自變量X1、X2、X3、X4、X5，肌苷產(chǎn)量為自變量Y，選擇五因素八水平的均勻設(shè)計(jì)模型(U8*(85))設(shè)計(jì)試驗(yàn).

5)試驗(yàn)因素水平 將檸檬酸鈉、NaF、CaCl2、次黃嘌呤、MnSO45個(gè)因素，結(jié)合前期已經(jīng)完成的單獨(dú)添加促進(jìn)劑的結(jié)果，設(shè)計(jì)8個(gè)水平進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化.因素及水平設(shè)置見表1，按照均勻設(shè)計(jì)模型設(shè)計(jì)的具體試驗(yàn)方案見表2.按表2所設(shè)計(jì)具體試驗(yàn)方案進(jìn)行肌苷搖瓶發(fā)酵，測(cè)得肌苷產(chǎn)量填入表2的響應(yīng)值欄.

表1 U8?(85)因素及水平表Tab1 FactorslevelsbasedonU8?(85)g/L水平Levels因素FactorsX1X2X3X4X5110．0010．0041．00．025220．0020．0081．50．050330．0030．0122．00．075440．0040．0162．50．100550．0050．0203．00．125660．0060．0243．50．150770．0070．0284．00．175880．0080．0324．50．200表2 BsCICC20958均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Tab2 ResultsofuniformdesignofBsCICC20958basedonU8?(85)g/L試驗(yàn)號(hào)No因素FactorsX1X2X3X4X5響應(yīng)值YResponsevalue110．0020．0164．00．2006．31220．0040．0323．00．1755．91330．0060．0122．00．1504．26440．0080．0281．00．1252．23550．0010．0084．50．1007．24660．0030．0243．50．0755．74770．0050．0042．50．0054．55880．0070．0201．50．0253．09

2 結(jié)果與討論

2.1 單一促進(jìn)劑對(duì)菌株Bs CICC20958發(fā)酵和肌苷產(chǎn)量的影響

2.1.1 檸檬酸鈉對(duì)Bs CICC20958菌株發(fā)酵的影響 檸檬酸鈉是一種研究較多的促進(jìn)劑，在提高肌苷產(chǎn)量方面可以達(dá)到很好的效果[15-17].在肌苷發(fā)酵的培養(yǎng)基中分別加入1、2、3和4 g/L的檸檬酸鈉，研究它們?cè)诩≤瞻l(fā)酵中對(duì)Bs CICC20958生物量及肌苷產(chǎn)量的影響，其結(jié)果如圖1所示.由圖1可以看出，添加0～3 g/L的檸檬酸鈉，生物量及肌苷產(chǎn)量隨著檸檬酸鈉添加量的增加而增加.當(dāng)檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為3～4 g/L時(shí)，肌苷及生物量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì).在3 g/L檸檬酸鈉條件下，生物量為32.08，肌苷的產(chǎn)量最高達(dá)到1.92 g/L，其中肌苷產(chǎn)量較不添加檸檬酸鈉的空白組提高了53%.據(jù)報(bào)道，檸檬酸鹽可以增強(qiáng)枯草芽胞桿菌對(duì)Ca2+的吸收，而Ca2+是丙酮酸激酶的一種強(qiáng)烈抑制劑，當(dāng)丙酮酸激酶活力下降時(shí)，會(huì)造成EMP途徑中的磷酸烯醇式丙酮酸大量積累，而磷酸烯醇式丙酮酸又是磷酸果糖激酶的強(qiáng)烈抑制劑.其次，磷酸果糖激酶是一種變構(gòu)酶，檸檬酸鹽和ATP都對(duì)其有變構(gòu)抑制的效果，胞內(nèi)的檸檬酸鹽可以通過(guò)加強(qiáng)ATP的抑制效應(yīng)來(lái)抑制磷酸果糖激酶.由此推斷，檸檬酸鈉可以同時(shí)降低枯草芽孢桿菌中心代謝途徑中的丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活力，使EMP途徑的流量減弱[5].另外，檸檬酸合成酶是TCA循環(huán)的限速酶，添加檸檬酸鈉會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制檸檬酸合成酶的活性[6]，所以添加適量檸檬酸鈉可以限制TCA代謝流量，減少碳架浪費(fèi).

2.1.2 CaCl2對(duì)菌株Bs CICC20958發(fā)酵和肌苷產(chǎn)量的影響 本試驗(yàn)在肌苷發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入了0、0.005、0.01、0.015和0.02 g/L的CaCl2，考察其對(duì)肌苷產(chǎn)量及生物量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，添加一定量的CaCl2可以有效促進(jìn)肌苷的合成.當(dāng)添加CaCl2質(zhì)量濃度為0.01 g/L時(shí)，肌苷產(chǎn)量比不添加CaCl2的空白組提高32%.當(dāng)CaCl2質(zhì)量濃度大于0.01 g/L 時(shí)，生物量及肌苷產(chǎn)量和CaCl2添加量成反比關(guān)系.作為丙酮酸激酶的抑制劑，添加適量的Ca2+可以有效降低丙酮酸激酶的活力[5]，使EMP途徑中的磷酸烯醇式丙酮酸不斷積累，進(jìn)而對(duì)磷酸果糖激酶產(chǎn)生相應(yīng)的抑制作用.從結(jié)果中還可以發(fā)現(xiàn)，在CaCl2質(zhì)量濃度為0.005～0.010 g/L時(shí)，隨著加入培養(yǎng)基中的CaCl2濃度的增大，生物量略有提高，但肌苷產(chǎn)量隨著CaCl2濃度的增加而迅速增加.Ca2+可以中和肌苷發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸等副產(chǎn)物，使發(fā)酵液的pH值維持在比較理想的水平，為菌體提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境.

2.1.3 NaF對(duì)菌株Bs CICC20958發(fā)酵和肌苷產(chǎn)量的影響 在肌苷發(fā)酵的培養(yǎng)基中加入0.001、0.002、0.003和0.004 g/L的NaF，考察其對(duì)肌苷發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖3.由圖3可知，添加NaF對(duì)肌苷產(chǎn)量和菌體生長(zhǎng)都具有一定的促進(jìn)作用，但是高濃度的NaF則不利于肌苷的積累.從圖3中還可以看出，NaF質(zhì)量濃度為0.003 g/L時(shí)，肌苷產(chǎn)量達(dá)到最高1.68 g/L，比不添加NaF的空白組提高35%.分析原因，可能是因?yàn)镹aF具有抑制細(xì)菌產(chǎn)酸的作用，可以明顯減弱培養(yǎng)基pH值的下降，一般可以使pH值保持在6.2以上[18].因此隨著NaF添加量的增加，枯草芽孢桿菌的生物量呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì).此外，氟化物是EMP途徑中烯醇化酶的強(qiáng)烈抑制劑，使該途徑的代謝流得到抑制，減弱了EMP途徑的通量，從而使得合成肌苷的代謝流增強(qiáng)，肌苷產(chǎn)量增加.

2.1.4 次黃嘌呤對(duì)菌株Bs CICC20958發(fā)酵和肌苷產(chǎn)量的影響 肌苷在枯草芽胞桿菌中的合成可以通過(guò)兩種不同的途徑來(lái)完成，即全合成途徑和嘌呤核苷酸的補(bǔ)救途徑[19].次黃嘌呤的添加可以為肌苷合成提供現(xiàn)成的嘌呤環(huán)，從而通過(guò)補(bǔ)救合成促進(jìn)肌苷產(chǎn)量的提高.因此，本實(shí)驗(yàn)考察了在培養(yǎng)基中分別添加0、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的次黃嘌呤對(duì)肌苷產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4.從圖4中可以看出，在考察范圍內(nèi)，肌苷的產(chǎn)量與次黃嘌呤的添加量成正比關(guān)系.根據(jù)報(bào)道[20-21]，這可能是因?yàn)樵诩≤盏陌l(fā)酵生產(chǎn)中，補(bǔ)救途徑具有重要的功能，因?yàn)樵谄浒l(fā)酵的后期，各種營(yíng)養(yǎng)成分的消耗會(huì)引起碳與氮之間比例的失調(diào)，以及pH值的改變，從而導(dǎo)致全合成途徑受到阻礙.此時(shí)，在培養(yǎng)基中添加嘌呤類物質(zhì)可以啟動(dòng)補(bǔ)救途徑，促進(jìn)肌苷的持續(xù)合成.據(jù)對(duì)次黃嘌呤和肌苷分子質(zhì)量的比較，1單位的次黃嘌呤理論上可以合成2單位的肌苷，這與本試驗(yàn)中添加次黃嘌呤濃度2.5 g/L，肌苷產(chǎn)量增加4.58 g/L的結(jié)果相當(dāng)，此時(shí)的肌苷產(chǎn)量是不添加次黃嘌呤空白組的4.66倍.

2.1.5 MnSO4對(duì)菌株Bs CICC20958發(fā)酵和肌苷產(chǎn)量的影響 在肌苷發(fā)酵培養(yǎng)基中嘗試加入0、0.025、0.05、0.075、0.1 g/L的MnSO4，考察其對(duì)肌苷發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖5.從圖5中可以看出，添加適量的MnSO4確實(shí)可以提高肌苷的產(chǎn)量.當(dāng)添加MnSO4質(zhì)量濃度為0.05 g/L時(shí)，肌苷產(chǎn)量為1.65 g/L，比不添加MnSO4的空白組提高32%.因?yàn)镸n2+是微生物生長(zhǎng)的必需元素，當(dāng)培養(yǎng)基中缺少M(fèi)n2+時(shí)，不適合Bs的生長(zhǎng)，但是會(huì)促進(jìn)芽孢的形成，對(duì)肌苷產(chǎn)量有抑制作用[22]，加入MnSO4后可以為菌體繁殖提供更多的空間.又因?yàn)镸n2+在適當(dāng)濃度時(shí)可以誘導(dǎo)6-磷酸葡萄糖脫氫酶，在HMP途徑中，肌苷合成的重要前體5-磷酸核糖即是6-磷酸葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶相繼催化完成的[13]，所以添加適當(dāng)濃度的MnSO4可以有效促進(jìn)肌苷產(chǎn)量的增加.

2.2 菌株Bs CICC20958組合添加促進(jìn)劑的均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化

表3 BsCICC20958均勻試驗(yàn)回歸方程顯著性分析Tab3 ResultsofregressionofBsCICC20958basedonuniformdesign因素Factors偏相關(guān)Partialcorrelationt-檢驗(yàn)t-testP值PvalueX1?X1-0．33800．37630．0412X2?X2-0．98110．27000．0001X3?X3-0．21900．30760．6023X1?X2-0．80930．56530．0150X2?X5-0．48600．30720．0222X3?X50．08280．34060．8455

對(duì)于已獲得的試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)DPS7.05軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，并采用二次多項(xiàng)式逐步分析得到肌苷產(chǎn)量(Y)對(duì)各個(gè)因素的回歸方程的顯著性分析(見表3)，所得到的回歸方程為：Y=6.1050+4.9668×10-2X1*X1-1.9170×104X2*X2-1.1467×103X3*X3-9.0327×10X1*X2-7.9151×102X2*X5+3.8487×102X3*X5，R2=0.9913，P=0.002439.可見，模型的P值小于0.05，說(shuō)明該模型高度顯著；方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9913，說(shuō)明僅有不到1%的肌苷產(chǎn)量變異不能用該模型解釋，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間有較高的相關(guān)度，可以用該回歸方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析.由表3可知，各因素之間存在一定的交互作用，對(duì)于肌苷產(chǎn)量的影響大小排序?yàn)閄2*X2>X1*X2>X2*X5>X1*X1>X3*X3>X3*X5.

通過(guò)軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行求導(dǎo)，可以得到各個(gè)因素的極值點(diǎn)，當(dāng)這些極值點(diǎn)組合后，理論上肌苷產(chǎn)量達(dá)到最大值，各種促進(jìn)劑的最佳參數(shù)見表4.

表4 各因子最優(yōu)參數(shù)

在最優(yōu)配方條件下進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)結(jié)果的驗(yàn)證試驗(yàn)，與不添加促進(jìn)劑時(shí)的肌苷產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，通過(guò)均勻設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法對(duì)添加促進(jìn)劑組合的方案進(jìn)行優(yōu)化，并采用優(yōu)化后的各促進(jìn)劑的最佳參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果使肌苷產(chǎn)量達(dá)到7.81 g/L.相對(duì)于優(yōu)化前不添加促進(jìn)劑的肌苷產(chǎn)量1.22 g/L，優(yōu)化后的肌苷產(chǎn)量提升了5.38倍，說(shuō)明將均勻設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法應(yīng)用于肌苷發(fā)酵過(guò)程中促進(jìn)劑組合添加方法的優(yōu)化是可行的.

3 結(jié)論

本文分別考察了5種促進(jìn)劑在不同濃度下對(duì)Bs CICC20958發(fā)酵產(chǎn)肌苷的影響，得到5種促進(jìn)劑單獨(dú)添加時(shí)的最佳質(zhì)量濃度(g/L)分別為：檸檬酸鈉3，CaCl20.01，NaF 0.003，次黃嘌呤2.5，MnSO40.05.在此基礎(chǔ)上，采用均勻設(shè)計(jì)方法優(yōu)化促進(jìn)劑組合添加的方案，結(jié)果顯示，當(dāng)同時(shí)添加檸檬酸鈉7.9 g/L、NaF 0.001 g/L、CaCl20.032 g/L、次黃嘌呤2.1 g/L、MnSO40.2 g/L時(shí)，可以使肌苷產(chǎn)量達(dá)到最大值.經(jīng)驗(yàn)證，在此條件下該菌株的產(chǎn)肌苷能力與不添加促進(jìn)劑相比提高了538%，達(dá)到7.81 g/L.

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(責(zé)任編輯 馬建華 英文審校 曹敏杰)

Effect of Accelerators on Inosine Production ofBacillussubtilisCICC20958

YOU Hong-yan1,2,YANG Zhe1,XIAO An-feng1,2,3,4,NI Hui1,2,3,4,CAI Hui-nong1,2,3,4,YANG Qiu-ming1,2,3,4

(1.College of Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China;2.Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering,Xiamen 361021,China;3.Research Center of Food Microbiology and Enzyme Engineering Technology of Fujian Province,Xiamen 361021,China;4.Research Center of Food Biotechnology of Xiamen City,Xiamen 361021,China)

According to the regulating mechanism of inosine synthesis,some kinds of effective additives(sodium citrate,NaF,CaCl2,hypoxanthine and MnSO4) were added inBacillussubtilisCICC20958.Then,the best composition of accelerators was obtained by uniform design.The results showed that optimized combination increased inosine production to 7.81 g/L in the presence of 7.9 g/L sodium citrate,0.001 g/L NaF,0.032 g/L CaCl2,2.1 g/L hypoxanthine and 0.2 g/L MnSO4.The yield of inosine was 5.38 times higher than that of the control group.

Bacillussubtilis；CICC20958；inosine；accelerator；uniform design

2013-09-17

[修回日期]2013-12-18 [基金項(xiàng)目]福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2011J01225);集美大學(xué)中青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(2010A006)

游洪燕 (1989—) ,女,碩士生,從事發(fā)酵工程方向研究.通訊作者：楊秋明(1977—) ,男,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,從事微生物方向研究,E-mail ：yangqm@jmu.edu.cn.

1007-7405(2014)02-0107-06

Q 936

A