侯俊德 宋子賢 張玉相 賈慧群

·論著·

血必凈對(duì)膿毒癥大鼠體內(nèi)MMP-9水平的影響及對(duì)肺臟的保護(hù)作用

侯俊德 宋子賢 張玉相 賈慧群

目的通過對(duì)膿毒癥大鼠血清中MMP-9濃度的影響并結(jié)合肺臟形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化，探討血必凈注射液對(duì)肺臟的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法選用雄性S-D大鼠45只隨機(jī)分為3組：空白組(Sham組)、鹽水組(NS組)、血必凈組(X組)，每組15只。檢測(cè)血清MMP-9水平、肺濕/干重比(W/D)、HE染色法光鏡觀察肺臟形態(tài)學(xué)改變，透射電鏡觀察肺臟血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果與Sham組比較，NS組、X組大鼠肺濕/干重比均明顯增大(P<0.01)；與NS組比較，X組肺組織濕/干重比顯著減小(P<0.01)。NS組、X組血清中MMP-9水平均顯著高于Sham組(P<0.01)；與NS組比較，X組血清中MMP-9水平下降(P<0.01)。Sham組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)及血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常；NS組有明顯炎性反應(yīng)及血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞等；X組改變明顯減輕但較Sham組重。結(jié)論血必凈注射液可減少血清MMP-9水平，從而減輕肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善肺血管通透性，對(duì)肺臟有一定的保護(hù)作用。

膿毒癥；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；血必凈注射液；血管內(nèi)皮細(xì)胞；肺損傷

膿毒癥是指病原微生物及其毒素、代謝產(chǎn)物侵入血液循環(huán)，激活宿主的細(xì)胞和體液免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和內(nèi)源性介質(zhì)，而引起的全身炎性反應(yīng)綜合征[1]。通過對(duì)膿毒癥病理生理研究發(fā)現(xiàn)，急性肺損傷(ALI)經(jīng)常最早出現(xiàn)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)損傷是影響上述演變的關(guān)鍵因素之一[2]。炎性因子基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9) 在其中的作用也逐漸受到關(guān)注[3]。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及部分臨床試驗(yàn)結(jié)果均初步肯定血必凈在聯(lián)合治療危重患者全身炎性反應(yīng)甚至膿毒癥中的療效[4,5]。本實(shí)驗(yàn)采用Sprague-Dawley大鼠肓腸結(jié)扎與穿孔(CLP)法致膿毒癥模型下，研究血必凈注射液對(duì)血清MMP-9濃度的影響并結(jié)合肺臟形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化，探討應(yīng)用血必凈注射液治療是否有效，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性Sprague-Dawley大鼠45只，體重250～300 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為3組(每組15只)：空白組(Sham組)，鹽水組(NS組)，血必凈組(X組)。Sham組：盲腸不結(jié)扎也不穿孔，余操作相同，術(shù)畢尾靜脈給予0.9%氯化鈉溶液4 ml/kg。NS組：盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)后，術(shù)畢尾靜脈給予0.9%氯化鈉溶液4 ml/kg。X組：CLP后給予血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司)4 ml/kg尾靜脈注射(生藥濃度為500 g/L)。

1.2 模型建立 Sprague-Dawley大鼠實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，實(shí)驗(yàn)時(shí)稱重。腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，相對(duì)無菌條件下行左側(cè)頸動(dòng)脈置管。采用經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)制模，其中Sham組不行盲腸結(jié)扎與穿孔，余操作相同。在造模6 h采血、取肺組織。

1.3 標(biāo)本采集及觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1 血清留?。河捎翌i總動(dòng)脈測(cè)壓管處緩慢采血2 ml，離心后留取上清液，轉(zhuǎn)入EP管，于-70℃凍存，待全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清中MMP-9含量。

1.3.2 肺組織留?。航?jīng)右頸動(dòng)脈采血處死后，開胸取右肺中葉，精確稱濕重，再置于85℃烤箱中24 h，至重量不再變化，稱干重，計(jì)算肺濕/干重比。

1.3.3 HE標(biāo)本留?。河捎翌i總動(dòng)脈采血處死動(dòng)物后，迅速剪取右肺下葉放入4%的多聚甲醛中，浸泡固定72 h后包埋蠟塊做HE染色用。

1.3.4 電鏡標(biāo)本留?。禾幩绖?dòng)物后，迅速剪取右肺下葉放入4%的戊二醛中固定，H-7500透射電子顯微鏡(日本日立)鏡檢。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，采用完全單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用非參數(shù)的秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肺組織濕/干重比(W/D)變化 與sham組比較，NS組大鼠肺組織W/D明顯增大(P<0.01)；X組肺組織W/D也顯著增加(P< 0.01)；與NS組比較，X組肺組織W/D顯著減小(P<0.01)。見表1。

2.2 3組大鼠血清MMP-9水平變化 NS組血清中MMP-9水平顯著高于Sham組(P<0.01)；X組水平也比Sham高(P<0.01)；與NS組比較，組MMP-9水平明顯下降(P<0.01)。見表1。

組別W/DMMP?9(ng/ml)Sham組4．54±0．164．5±1．0NS組5．15±0．11?11．5±1．7?X組4．74±0．08?#7．5±1．8?#

注：與Sham組比較，*P<0.01；與NS組比較，#P<0.01

2.3 肺組織病理學(xué)改變

2.3.1 HE染色光鏡下觀察：Sham組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔無水腫，肺泡腔清晰；NS組肺泡間隔增寬，肺間質(zhì)充血、水腫，肺泡腔可見大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，可見不同程度的肺不張，代償性肺氣腫等；X組改變明顯減輕但較假手術(shù)組重(圖1～3)。

2.3.2 電鏡下觀察：Sham組基本正常，內(nèi)皮細(xì)胞邊緣清楚，細(xì)胞連接緊密，胞內(nèi)可見少量吞飲小泡；NS組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞連接模糊不清，胞漿內(nèi)含有大量吞飲小泡；X組內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有少量吞飲小泡，可見內(nèi)皮細(xì)胞間隙(圖4～6)。

圖1 Sham組肺組織病理變化(HE×200)

圖2 NS組肺組織病理變化(HE×200)

圖3 X組肺組織病理變化(HE×200)

圖4 Sham組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞病理變化(透射電鏡×3000)

圖5 NS組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞病理變化(透射電鏡×3000)

圖6 X組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞病理變化(透射電鏡×3000)

3 討論

膿毒癥是感染導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征為特征的臨床癥候群，其發(fā)病率和病死率均很高[1]，其中肺臟是膿毒癥時(shí)最易受損的靶器官。在膿毒癥的發(fā)展過程中，肺損傷的主要病理特征是肺內(nèi)炎性反應(yīng)失控導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管損傷[6]，通透性增高，引起肺泡滲出液中富含蛋白質(zhì)的肺水腫及透明膜形成，導(dǎo)致ALI/ARDS[7]。近年來，抗感染治療和器官功能支持技術(shù)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但嚴(yán)重膿毒癥的病死率仍高達(dá)30%～70%[8]。

本實(shí)驗(yàn)采用CLP模型，這是目前比較公認(rèn)的臨床相關(guān)性較強(qiáng)的膿毒癥動(dòng)物模型[9]。實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，在CLP后2～3 h大鼠可自由飲水，NS組6 h出現(xiàn)精神倦怠、躁動(dòng)、寒戰(zhàn)、腹脹、眼角分泌物增多、豎毛等表現(xiàn)，剖腹見腹腔內(nèi)有血性滲出液，盲腸腫脹變黑、發(fā)生粘連，空腸腸管脹氣等表現(xiàn)，與Wu等[10]報(bào)道的膿毒癥大鼠動(dòng)物模型基本相同，符合膿毒癥的表現(xiàn)，制模成功。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類由金屬離子作為輔酶參與全酶構(gòu)成的蛋白質(zhì)水解酶[11],在正常情況下MMPs表達(dá)量很少，但活化的中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等可釋放大量的MMP-8和MMP-9等，其中MMP-9因作用底物廣泛,表達(dá)細(xì)胞眾多而備受重視，成為最近國(guó)際國(guó)內(nèi)研究的焦點(diǎn)之一[10]。MMP-9一旦過度表達(dá)能夠降解血管基底膜，增加血管通透性，促進(jìn)中性粒細(xì)胞在組織的粘附和浸潤(rùn)，進(jìn)一步釋放 TNF-α、IL-6 等炎性因子，進(jìn)一步促進(jìn) MMP-9 的生成和釋放，形成炎性反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)[12]，嚴(yán)重者導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征。在ARDS動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，MMPs抑制劑可減緩其病理進(jìn)程[13]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。它不僅是膿毒癥發(fā)生時(shí)受損的靶器官，還通過其廣泛的生物學(xué)功能主動(dòng)參與了器官功能的損傷[14]。是凝血啟動(dòng)和炎性反應(yīng)激活過程中重要的效應(yīng)細(xì)胞，而膿毒癥病理生理學(xué)變化是嚴(yán)重全身感染引起的炎性反應(yīng)過度激活及凝血機(jī)能障礙。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和功能障礙是膿毒癥發(fā)展惡化的中心環(huán)節(jié)。

中醫(yī)中藥對(duì)膿毒癥患者有較好療效。血必凈注射液是赤芍藥、川芎、丹參、紅花等活血化瘀藥提取物，大量基礎(chǔ)研究以及臨床實(shí)踐證明,血必凈注射液具有強(qiáng)效抗內(nèi)毒素作用，也有強(qiáng)效拮抗源性炎性介質(zhì)、失控性釋放的作用,改善彌漫性血管內(nèi)凝血的凝血機(jī)制異常，調(diào)節(jié)過高或過低的免疫反應(yīng)，保護(hù)和修復(fù)應(yīng)激狀態(tài)下受損的臟器[15]。據(jù)報(bào)道血必凈能改善CLP術(shù)后膿毒癥大鼠多器官功能異常，并降低動(dòng)物的病死率[16]。

本試驗(yàn)通過對(duì)膿毒癥大鼠一般情況觀察、肺濕干重比變化、血清MMP-9水平變化，以及肺臟病理學(xué)顯示，必凈注射液能夠改善膿毒癥大鼠的一般狀況，減輕炎性反應(yīng)和毛細(xì)血管滲漏，減輕膿毒癥大鼠肺損傷，改善肺功能，這可能與減少M(fèi)MP-9的過度釋放、活化，減輕肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)。

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本刊編輯部

EffectofXuebijinginjectiononMMP-9levelsanditsprotectioneffectonlungsofratswithsepsis

HOUJunde*,SONGZixian,ZHANGYvxiang,etal.*DepartmentofAnesthesia,HandanCentralHospital,Hebei,Handan056001,China

ObjectiveTo investigate the changes of serum levels of MMP-9 and the pathological changes of lung tissue in rats with sepsis induced by CLP,and to explore the protection effect and action mechanism of Xuebijing injection.MethodsForty five male SD rats were randomly divided into 3 groups: blank group,NS group and Xuebijing group.Serum MMP-9 levels and the ratio of lung wet/dry weight were determined.The pathologic changes of lung were observed by means of light microscopy and transmission electron microscopy.ResultsAs compared with that in blank group,the ratio of lung wet/dry weight in NS group and Xuebijing group was significantly increased (P<0.01),however,as compared with that in NS group,the ratio of lung wet/dry weight in Xuebijing group was significantly decreased (P<0.01).The serum levels of MMP-9 in NS group and Xuebijing group were significantly higher than those in blank group (P<0.01).As compared with those in NS group,the serum levels of MMP-9 in Xuebijing group was significantly decreased (P<0.01).The lung tissue structures and vascular endothelial cell structures in blank group were basically normal,however,obvious inflammatory reaction and vascular endothelial cell structure injury were found in NS group,which in Xuebijing group were obviously relieved,however,which were severer than those in blank group.ConclusionXuebijing injection can reduce MMP-9 levels,as a result,which can relieve lung vascular endothelial cell injury and improve pulmonary vasopermeability,so Xuebijing injection has certain protection effect on lungs.

sepsis；MMP-9; Xuebijing injection; vascular endothelial cell injury; lung injury

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.05.001

056001 河北省邯鄲市中心醫(yī)院麻醉科(侯俊德)；河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院麻醉科(宋子賢、賈慧群)，ICU(張玉相)

R 631.2

A

1002-7386(2014)05-0645-03

2013-11-28)