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深圳市婦女宮頸癌組織中人乳頭瘤病毒16型E6、E7致癌基因的序列分析

2014-08-25 03:41:38關(guān)嵩青
關(guān)鍵詞:克隆質(zhì)粒宮頸癌

關(guān)嵩青,林 莉,葉 菲

(深圳市第二人民醫(yī)院 婦科,廣東 深圳518035)

近年來眾多各國(guó)學(xué)者對(duì)宮頸癌的病因以及宮頸鱗狀上皮細(xì)胞發(fā)生癌變機(jī)制的分子流行病學(xué)研究資料表明,99.7%的宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程與人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV),特別是與高危型人乳頭瘤病毒(High-risk HPV,HR-HPV)的持續(xù)感染密切相關(guān)[1],是宮頸癌的主要致癌因素。在目前所有已知的HR-HPV亞型中,感染率最高的是 HPV16型,約占58%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,與其他的HPV亞型相比,HPV16 型更容易在宮頸鱗狀上皮細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期復(fù)制生存[2],引起宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤樣病變(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)[3]的可能性更大,它是通過致癌基因E6的原癌蛋白與p53相互作用,形成新的蛋白復(fù)合物,使p53降解、功能減弱甚至喪失,破壞p53介導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)DNA 損傷的免疫應(yīng)答,導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂,不斷加重DNA 損傷,最終引起癌變[4];另一方面通過致癌基因E7的原癌蛋白與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)結(jié)合,激活細(xì)胞周期,引起組織細(xì)胞增殖[5]。由此可見,HR -HPV E6、E7基因都是早期致癌基因,它們二者在宮頸上皮細(xì)胞的表達(dá)在其癌變發(fā)生過程和維持惡變細(xì)胞惡性表型兩方面都起著極其重要的作用。

為了解深圳市宮頸癌患者癌組織中HPV16型E6、E7致癌基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),本研究對(duì)我院1 例在深圳市居住了17年、HPV16型感染的宮頸癌患者的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行了HPV16型 E6、E7致癌基因克隆及一級(jí)結(jié)構(gòu)分析,探討深圳市HPV16型地方株與德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株 E6、E7基因核苷酸序列的差異。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

來源于深圳市第二人民醫(yī)院宮頸癌手術(shù)切除組織標(biāo)本,組織病理診斷為宮頸鱗狀細(xì)胞癌,按FIGO 分期為Ⅱb期,特異性PCR 分型確定為HPV16 型陽(yáng)性。該患者40歲,至發(fā)病止在深圳居住生活17年。

1.2 HPV16型E6基因檢測(cè)

1.2.1 設(shè)計(jì)、合成PCR引物 設(shè)計(jì)HPV PCR L1基因引物和HPV16型E6基因引物是參考GenBank的德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株中的序列,自行設(shè)計(jì),引物序列如下:MY09:5′-GCCTMCRAGRAGAWTCAGCT-3′;MY11:5′-CGCMGAGGCWTAAAAYTAGG-3′;HPV16 E6上游:5′-AGTAGCTGCGTAAGAAATGA-3′;HPV16 E6下游:5′-TTTGTTACGGTTCGGATAC-3′。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增HPV16型 E6基因及HPV L1基因 提取本例宮頸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本癌細(xì)胞中的DNA,作為樣板,在高保真Taq酶的作用下PCR擴(kuò)增HPV L1基因,將PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳,電泳所測(cè)得的序列與Blast序列比對(duì)分型,挑選出HPV16型標(biāo)本,再用HPV16型E6基因引物對(duì)其PCR擴(kuò)增,挑選在500 bp附近處出現(xiàn)DNA帶的標(biāo)本,最后予以純化。

1.2.3 檢測(cè)序列 把前述已提純的PCR產(chǎn)物在DNA自動(dòng)序列分析儀(AB I3730型)上通過MY11、MY09引物的作用,用PCR直接測(cè)序法,對(duì)目標(biāo)基因的正負(fù)雙鏈從正反雙方向同時(shí)測(cè)序,對(duì)突變標(biāo)本則重新PCR擴(kuò)增,反復(fù)測(cè)序,旨在防止PCR擴(kuò)增過程產(chǎn)生的誤差,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不精確。應(yīng)用同樣方法對(duì)HPV16 E6基因的目標(biāo)基因正、負(fù)鏈從正、反雙方向予以測(cè)序。

1.2.4 HPV 16型 E6基因多態(tài)性分析 以Blast序列與前述測(cè)出的序列進(jìn)行比對(duì)分型,應(yīng)用DNAstar5.0和MEGA3.1軟件分析HPV16型E6基因的多態(tài)性。

1.3 HPV16型 E7 基因測(cè)定

1.3.1 質(zhì)粒和宿主菌 在Promega公司購(gòu)買pGEM-Teasy載體,采用揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供宿主菌DH5α。

1.3.2 試劑 常規(guī)的分子生物學(xué)試劑如異丙基硫代-β-D-半乳糖苷( IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶等上海生物工程公司購(gòu)買,在大連寶生物公司購(gòu)買DNA Marker和T4DNA連接系統(tǒng),在QIAgen公司購(gòu)買凝膠回收試劑盒和DNA提取試劑盒

1.3.3 癌組織DNA提取 嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒上的說明書進(jìn)行,采用標(biāo)準(zhǔn)的酚、氯仿方法提取宮頸癌標(biāo)本組織中的DNA。

1.3.4 擴(kuò)增HPV16型E7基因 (1)設(shè)計(jì)特異性引物:以GenBank收錄的德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株全序列DNA為樣板,做適當(dāng)調(diào)整后,自行設(shè)計(jì)包含HPV16型E7基因完整閱讀框(562-858)在內(nèi)的特異性引物:下游引物:5′-GGAAGCTTTTATGGTTTCTGAGAAC-3′;上游引物:5′-GCGAATTCATCATGCATGGAGATACACC-3′;同時(shí)在上游引物5′端設(shè)計(jì)了EcoRI酶切位點(diǎn),在下游引物5′端設(shè)計(jì)了HandIII酶切位點(diǎn)。

(2)以宮頸癌組織標(biāo)本癌細(xì)胞中提取的DNA作為模板,用PCR法在HPV16型的特異性引物的作用下進(jìn)行型別鑒定,之后用E7基因的特異性引物PCR擴(kuò)增HPV16型E7基因。擴(kuò)增參數(shù)定為:94℃5 min,94℃40 s,57℃1 min,72℃1 min,四個(gè)步驟循環(huán)30次,最后一次循環(huán)72℃延伸6 min。

1.3.5 克隆HPV16型E7基因 對(duì)經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳找到E7擴(kuò)增帶,把相應(yīng)的凝膠片段用凝膠回收試劑盒回收,將目標(biāo)片段與載體pGEM-Teasy連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中,經(jīng)過藍(lán)白斑篩選,最后用HandIII、EcoRI雙切酶進(jìn)行酶切鑒定。

1.3.6 測(cè)定HPV16型E7基因的序列 由上海生工生物工程公司對(duì)HPV16型E7基因的序列進(jìn)行測(cè)定。運(yùn)用DNAStar軟件分析所測(cè)得的E7基因序列。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增HPV16 型E6、E7基因的結(jié)果

以本例宮頸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本癌細(xì)胞中的DNA 為樣板,在高保真Taq酶的作用下,PCR法擴(kuò)增HPV L1基因,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳,在約500 bp 處清晰可見到一特異的條帶(圖1),與預(yù)計(jì)片斷大小一致。

2.2 HPV16型 E6、E7基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將PCR 擴(kuò)增所得產(chǎn)物回收后,連接線性克隆載體pGEM-Teasy,構(gòu)建成了HPV16 E6E7 2p GEM-Teasy重組質(zhì)粒。之后將前述的重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化,以及Hand Ⅲ和EcoRI雙酶切鑒定后,進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。結(jié)果酶切電泳顯示預(yù)計(jì)的片段與重組質(zhì)粒的插入片段大小一致(圖2)。

圖1 HPV16 E6E7基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 HPV16 E6E7重組質(zhì)粒

2.3 HPV16型 E6、E7 基因序列測(cè)定及分析

由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司將插入的重組質(zhì)粒用T3、T7通用引物從正、反兩個(gè)方向測(cè)序,測(cè)序得深圳地方株HPV16型 E6、E7基因序列。用DNAStar軟件比較GenBank收錄的德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株HPV16型E6、E7基因序列和本研究中測(cè)序克隆所得的HPV16型 E6、E7 基因序列,結(jié)果表明德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株HPV16 型E6、E7基因序列與本研究中克隆的HPV16型 E6、E7 基因序列完全相同。

3 討論

多項(xiàng)研究資料表明高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)是一種嗜組織鱗狀上皮細(xì)胞DNA的無包膜病毒,其基因組約長(zhǎng)8 kb,呈雙鏈高度螺旋化的環(huán)狀結(jié)構(gòu),包含3個(gè)功能區(qū):長(zhǎng)控制區(qū)(long control region,LCR)、早期基因區(qū)( E 區(qū))和晚期基因區(qū)(L 區(qū))。其中早期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因組長(zhǎng)約4 500 bp,包含6個(gè)開放讀碼結(jié)構(gòu)(ORF),它們分別編碼E1 、E2-E7 6 個(gè)早期蛋白,共同參與病毒DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、翻譯和調(diào)控等過程。其中HPV16型 E6 基因組全長(zhǎng)包含477 個(gè)核苷酸,從83 位到559 位,分別對(duì)151 個(gè)氨基酸殘基的病毒原癌蛋白進(jìn)行編碼。E6基因與p53的相互作用是E6 基因的致癌關(guān)鍵,它可引起p53 降解、功能減弱甚至喪失,使其減弱或喪失對(duì)細(xì)胞增殖周期中多個(gè)相關(guān)因子,如Cyclins、p21、Cdks、PCNA 等因子的調(diào)節(jié)作用,不斷加重了細(xì)胞中DNA 受損,最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變[4]。E7基因組全長(zhǎng)包含297個(gè)核苷酸,從562 位到858 位,分別對(duì)98 個(gè)氨基酸殘基的病毒原癌蛋白進(jìn)行編碼,該基因組是病毒的主要轉(zhuǎn)化基因,它編碼了病毒的E7 蛋白,后者是含有“Cys2X2X2Cys”鋅指結(jié)構(gòu)的細(xì)胞DNA結(jié)合蛋白。E7 蛋白的C 端有2 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),N 端有37個(gè)氨基酸,是E7蛋白的活性轉(zhuǎn)化區(qū),其結(jié)構(gòu)與SV40 T和腺病毒E1 A 抗原的結(jié)構(gòu)類似,能與抑癌基因蛋白R(shí)b、P53等相結(jié)合,干擾后者的抑癌功能,可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、永生化以及使細(xì)胞維持惡性的表型[6]。Song等[7]認(rèn)為,在 HR -HPV致癌過程中,在癌產(chǎn)生的早期E7基因主要導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)形,在癌產(chǎn)生的后期E6基因主要引起細(xì)胞惡化。

眾多研究人員在不同地區(qū)和國(guó)家從不同角度對(duì)當(dāng)?shù)豀PV16型E6、E7基因分析的過程中,發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)HPV16型E6、E7基因之間存在一些細(xì)小差異。目前研究結(jié)果顯示,HPV16 型不同類型的變異株具有不同的致癌潛能和生物學(xué)活性[8]。有研究認(rèn)為,病毒的致癌能力的強(qiáng)弱一方面與病毒的變異和類型相關(guān),另一方面也與宿主的HLA 多態(tài)性相關(guān)。因此病毒變異株的致癌能力可能會(huì)因?yàn)榈貐^(qū)不同而發(fā)生某些變化[9]。Yamada Matsumoto等[9]報(bào)道在日本宮頸癌患者中野生型E6 基因(德國(guó)株)分布的頻率大概為34%,然而Zehbe 等[8]報(bào)道在瑞士宮頸癌患者中該基因分布頻率僅約為6%,與印度宮頸癌患者人群中該基因的分布頻率是基本相同的[10]。參考世界各地文獻(xiàn),T350G是最有特征性的E6 基因突變,但在不同的地區(qū)此變異的分布頻率不同,為3.8%-78%。在我國(guó),高慧等[11]設(shè)計(jì)了一對(duì)跨越HPV16型 E7基因全長(zhǎng)的引物,進(jìn)行序列測(cè)定后,與網(wǎng)上公布的非洲株、東亞株、德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株、香港株、亞美株等HPV16型 E7基因序列予以比較,發(fā)現(xiàn)在核苷酸水平上揚(yáng)州地方株與德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株99.7%是一致的,僅在E7基因的ORF199位上的T變成了C,即核苷酸三聯(lián)密碼TTG變成CTG,但其所編碼的氨基酸結(jié)構(gòu)與德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株一致,尤其是N端蛋白活性轉(zhuǎn)化區(qū)的37個(gè)氨基酸以及C端的60個(gè)氨基酸完全相同,說明了德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株(野生型)與揚(yáng)州地方株的HPV16型E7基因序列是大致相同的。學(xué)者們根據(jù)各地文獻(xiàn)所報(bào)道不同地區(qū)HPV16型 E7基因序列,制作了該基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化圖,該圖清晰顯示東亞株、香港株、德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株與揚(yáng)州地方株距離接近,可視為是一個(gè)系列,而非洲株和亞美株則相互接近,可視為是另一個(gè)系列,提示HR-HPV16型 E6、E7基因的突變具有明顯的地域性差異。伍欣星[12]等研究發(fā)現(xiàn)湖北地區(qū)HPV16型E7基因了出現(xiàn)新的變異株,經(jīng)序列測(cè)定顯示有兩個(gè)堿基出現(xiàn)了C→T突變,直接導(dǎo)致這兩個(gè)堿基所編碼的氨基酸序列的C端蛋白多肽因基因的突變提前終止,但N端則是完整的。

本組資料從深圳地區(qū)1例宮頸癌患者臨床手術(shù)標(biāo)本組織中成功擴(kuò)增出HPV16型 E6、E7 基因,克隆到pGEM-Teasy載體中,再經(jīng)酶切鑒定、測(cè)序后發(fā)現(xiàn)所克隆的HPV16型 E6、E7 全基因序列與Genebank 德國(guó)株序列完全一致,為日后進(jìn)一步研究HPV 16 型E6、E7 基因及其蛋白表達(dá)提供了資料,為與HPV16型相關(guān)的宮頸癌治療性疫苗及診斷試劑的研發(fā)及宮頸癌防治等工作提供了信息。

作者簡(jiǎn)介:關(guān)嵩青(1968-),女,副主任醫(yī)師,主要從事婦產(chǎn)科臨床宮頸病變篩查及治療工作。

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