劉洪雨，莽 靖，楊 樂,胥桂華，李宗樹,王嬌琦,何金婷*，徐忠信*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春130021)

突觸蛋白(Synapsin)是反映神經(jīng)元、突觸功能狀況的內(nèi)在標志物[1]，本研究應(yīng)用PC12細胞進行氧糖剝奪處理，建立缺血性腦損傷模型，采用Western blot方法檢測不同時間氧糖剝奪模型細胞中的Synapsin蛋白表達，探討Synapsin蛋白在氧糖剝奪模型中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 細胞株

PC12細胞株(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤)購自北京銀紫晶生物技術(shù)公司。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自北京鼎國公司；鼠神經(jīng)生長因子(NGF)、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；抗突觸素抗體購自武漢博士德生物技術(shù)公司；Model550酶聯(lián)分析儀：美國BIO-RAD；激光共聚焦顯微鏡：日本OLYMPUS。

1.3 實驗方法

PC12細胞經(jīng)NGF刺激6 d后應(yīng)用含有連二亞硫酸鈉的無糖DMEM培養(yǎng)液洗滌細胞3次，繼而繼續(xù)應(yīng)用無糖DMEM培養(yǎng)液孵育細胞，并放入37℃孵箱內(nèi)的缺氧罐內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)[2]。

接種于6孔板內(nèi)的PC12細胞經(jīng)NGF(100 ng/ml)連續(xù)刺激后，分別進行氧糖剝奪3 h，6 h， 9 h，12 h和24 h，而后消化、收集細胞，RIPA冰上裂解20 min，12 000轉(zhuǎn)/min，離心5 min，取上清液。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，恒流1 mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5 hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，50%甲醇脫色至背景清晰，雙蒸水清洗，風干夾于兩層濾紙中保存。用0.01M PBS洗膜，5 min×3次。加入包被液，室溫平穩(wěn)搖動2 h。棄包被液，0.01M PBS再次洗膜，5 min×3次。一抗4℃孵育過夜，而后0.01M PBS洗膜，5 min×4次。使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋)，室溫孵育2 h。棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5 min×4次。加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)[2-3]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PC12細胞形態(tài)學(xué)變化

培養(yǎng)3天后，PC12細胞開始停止分裂。并逐漸分化為具有交感神經(jīng)元特征的細胞，開始長出神經(jīng)突起，培養(yǎng)5天后，大多數(shù)PC12細胞轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴诮桓猩窠?jīng)元的形態(tài)，突起逐漸增多并延長，形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時間的延長，交感神經(jīng)元樣細胞的胞體逐漸增大[4]。

2.2 MTT法檢測氧糖剝奪后細胞活力

用MTT法檢測氧糖剝奪后3 h、6 h、9 h、12 h、16 h、24 h的細胞存活率，如圖1所示，隨OGD時間的延長，細胞存活率明顯下降，而OGD12 h后細胞存活率下降更明顯，OGD24 h細胞存活率為65.8%，與對照組比，差異顯著(P<0.05)。

圖1 PC12 氧糖剝奪后不同時間細胞活力

2.3 Synapsin蛋白的表達變化

應(yīng)用Western Blot檢測氧糖剝奪模型處理的PC12細胞內(nèi)Synapsin蛋白的表達，如圖2和對照組相比較，隨NGF誘導(dǎo)時間的延長，與對照組(P<0.05)，相比細胞Synapsin蛋白的表達逐漸變淺。

3 討論

缺血性腦損傷是一個復(fù)雜、多因素、多層次的病理變化過程，其中腦缺血發(fā)生后引發(fā)的一系列缺血級聯(lián)反應(yīng)是其根本因素。因此，針對缺血性腦損傷發(fā)生機制的研究具有重要意義。PC12細胞來源于鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤(一種交感神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤)主要分泌產(chǎn)物為兒茶酚胺類遞質(zhì)包括多巴胺、去甲腎上腺素等。膜上有NGF受體，受生理水平NGF誘導(dǎo)后停止分裂，長出神經(jīng)突起，分化為具有交感神經(jīng)元特性的細胞，常被用于分析神經(jīng)元分化和NGF作用分子機制的研究，也被用于研究生長因子調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞基因表達改變的機制[5]。

圖2 OGD不同時間synapsin蛋白的表達變化

氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation/OGD)是在細胞水平上模擬缺血/低氧刺激的經(jīng)典模型。通過對細胞培養(yǎng)條件的改變，包括將細胞放入低氧箱或者更換無糖的培養(yǎng)基，可模擬細胞在缺血/低氧情況下的損傷，細胞會產(chǎn)生壞死、凋亡、自噬等現(xiàn)象[6]。本研究應(yīng)用PC12細胞模擬細胞缺血/低氧損傷后，建立氧糖剝奪模型，分別觀察OGD3 h、6 h、9 h、12 h、24 h不同時間，并采用MTT法分析細胞的存活率，結(jié)果顯示，隨氧糖剝奪時間增加，神經(jīng)元存活率由99.7%下降至64.3%，表明模擬缺血缺氧對神經(jīng)元產(chǎn)生了影響。

突觸蛋白(Synapsin)是一種與突觸相關(guān)同時具有神經(jīng)元特異性的磷酸蛋白，是一種反應(yīng)神經(jīng)元及突觸功能狀況的內(nèi)在標志物，突觸素(Synaptophysin)可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元突起的延長、參與突觸發(fā)生的過程[7]。通過磷酸化和非磷酸化來調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放對神經(jīng)元的早期發(fā)育和再生也起著至關(guān)重要的作用。關(guān)于腦缺血后突觸蛋白的表達變化，國內(nèi)外研究結(jié)果并不一致[8]。本研究表明氧糖剝奪后突觸蛋白表達和PC12細胞活率呈正相關(guān)，Synapsin蛋白參與突觸囊泡的介導(dǎo)轉(zhuǎn)運、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸囊泡循環(huán)，參與突觸發(fā)生[9]，研究證實，突觸蛋白是反映神經(jīng)元和突觸反映神經(jīng)元、突觸功能狀況的內(nèi)在標志物，本研究同時采用Western Blot檢測氧糖剝奪PC12細胞內(nèi)Synapsin蛋白表達變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著氧糖剝奪時間的延長，Synapsin蛋白表達水平逐漸降低，提示神經(jīng)元缺血后隨時間變化，神經(jīng)細胞的神經(jīng)元特性、突觸功能逐漸減低。突觸蛋白在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，并參與中樞神經(jīng)元早期發(fā)育，因此，調(diào)節(jié)腦缺血后突觸蛋白的表達可能作為診治腦缺血后病理、生理改變的一種方法，也為研究腦缺血后神經(jīng)再生和可塑性提供一種途徑。

作者簡介：劉洪雨，女，在讀碩士，主要研究方向：缺血性腦損傷與保護研究。

參考文獻：

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