付璐璐，鄭連文，徐耀宏,張靜文，梁文君，高利偉，胡文宇，王春強(qiáng)

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科生殖中心，吉林 長(zhǎng)春130041；2.赤峰市醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰024000；3.吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130000；4.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州210700)

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一,在神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的發(fā)揮等方面起著重要作用[1]。除作用于神經(jīng)系統(tǒng)外,對(duì)心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等也有影響，很早就有研究表明哺乳動(dòng)物的睪丸、附睪、前列腺中有NGF及其受體存在[2]。NGF對(duì)哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)的影響是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一，本研究將NGF對(duì)小鼠支持細(xì)胞的作用進(jìn)行初步探索，為進(jìn)一步闡明NGF對(duì)雄性動(dòng)物睪丸發(fā)育及精子發(fā)生過(guò)程的調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料一周齡小白鼠、膠原酶(0.5 mg/ml)、胰酶(0.5 mg/ml)、PBS(0.3 mg/ml)、混合酶消化液 (0.1% collagenase,0.4% hyaluronidase,0.08% Dnase I和0.03% trypsin inhibitor)、培養(yǎng)基、顯微鏡、濾網(wǎng)、鑷子、剪刀、蒸餾水等。

1.2方法(1)2個(gè)睪丸去膜后，放入10 ml PBS中洗兩次，沉底；(2)將曲細(xì)精管加入4 ml膠原酶(0.5 mg/ml)中， 80 轉(zhuǎn)/min,33 ℃，10-15 min，沉底；(3)放入10 ml PBS中洗兩次，加入4 ml胰酶(0.5 mg/ml)消化5-10 min，34℃不搖；(4)放入10 ml PBS中洗兩次，用含4 ml trypsin inhibitor的PBS(0.3 mg/ml)洗一次.沉底(2 min)；(5)加入4 ml混合酶消化液(0.1% collagenase,0.4% hyaluronidase,0.08% Dnase I和0.03% trypsin inhibitor) 80 轉(zhuǎn)/min,34℃，40 min；(6)離心500 rpm,4 min，放入3 ml PBS中洗兩次；(7)低滲純化SCs：1 ml PBS懸浮,加2.5 ml的1∶10稀釋的PBS，共3.5 ml，顛倒混3次，離心500 rpm,4 min；(8)10 ml的DMEM/F12洗兩次，10 ml重懸，計(jì)數(shù)后鋪板；(9)支持細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及HE染色；(10)油紅O染色鑒定睪丸支持細(xì)胞；(11)置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，并隨時(shí)觀察兩個(gè)培養(yǎng)皿中細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果顯示支持細(xì)胞凸起較多，細(xì)胞核呈類圓形，核仁清晰，胞漿淡染，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大小不一的空泡。

2.2油紅O染色顯示HE染色后的空泡結(jié)構(gòu)被油紅染為橘黃色，大小不等，呈懸浮狀態(tài)，其實(shí)質(zhì)為脂質(zhì)小滴，散落在支持細(xì)胞中(見(jiàn)圖1)。

2.3 48小時(shí)后對(duì)照組體外培養(yǎng)的小鼠睪丸支持細(xì)胞未見(jiàn)明顯生長(zhǎng)，NGF組小鼠睪丸支持細(xì)胞3-4小時(shí)生長(zhǎng)即可以貼壁，48小時(shí)候已經(jīng)長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿(見(jiàn)圖2)。

圖1 油紅O鑒定支持細(xì)胞的純度(×400)

圖2 NGF組培養(yǎng)48小時(shí)后支持細(xì)胞(×100)

3 討論

近年來(lái)，人們?cè)谏窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)素對(duì)雄性動(dòng)物繁殖系統(tǒng)作用的研究上取得了一定的進(jìn)展。其中， NGF 的作用研究的最早，也較為系統(tǒng)。人們最先在小鼠的睪丸中發(fā)現(xiàn)了片段長(zhǎng)度分別為 1.3 kb和1.5 kb的NGF的兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。它們均存在于小鼠睪丸中的精母細(xì)胞和早期精原細(xì)胞中。如果把大鼠睪丸支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和管周細(xì)胞分離培養(yǎng)數(shù)天后，仍可以在細(xì)胞中檢測(cè)出有大量NGF的表達(dá)。因此，可以得出結(jié)論，上述3種細(xì)胞均可以表達(dá)并分泌NGF[3]。在新生小鼠睪丸內(nèi)，NGF的高親合力受體TrkA在生殖細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)，但表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞中[4]。此后，在小鼠和人睪丸中的報(bào)道中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[5]。說(shuō)明NGF可以通過(guò)自分泌或旁分泌的方式影響哺乳動(dòng)物睪丸的發(fā)育，進(jìn)而影響精子的發(fā)生。關(guān)于NGF在睪丸中的作用途徑，近年來(lái)，人們也進(jìn)行了大量的研究。研究發(fā)現(xiàn)，生殖激素是調(diào)節(jié)NGF在哺乳動(dòng)物睪丸功能發(fā)揮的關(guān)鍵。大鼠的垂體被摘除后，大鼠曲細(xì)精管中NGF受體TrkA 的表達(dá)量顯著降低，有些細(xì)胞甚至不再表達(dá)TrkA，說(shuō)明垂體分泌的促性腺激素可以通過(guò)抑制TrkA表達(dá)影響NGF的功能的發(fā)揮[6]。此外，通過(guò)向大鼠體內(nèi)注射hCG12h后，睪丸細(xì)胞內(nèi)的TrkA水平顯著的提高。核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明，TrkA的mRNA水平在VⅡ和VⅢ期的表達(dá)最高[7]；睪酮也能影響 TrkA 的表達(dá)。當(dāng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞被破壞或雄激素受體被阻斷后，TrkA 的 mRNA 水平顯著的提高，然而，睪酮的處理卻會(huì)抑制 TrkA的表達(dá)[6]。以上說(shuō)明雄激素可以調(diào)節(jié)睪丸中 NGF/TrkA 的信號(hào)傳遞。4-甲基兒茶酚(4-methylcatechol,4-MC)是促進(jìn)NGF合成的一種兒茶酚類衍生物。當(dāng)用10 μg/kg的4-MC 連續(xù)處理成年大鼠10天后，可顯著的提高血漿中NGF的水平，同時(shí)，能表達(dá)TrkA的組織中TrkA 的表達(dá)量都顯著提高。在成年的大鼠中，精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子中均有TrkA的表達(dá)，但是從表達(dá)量來(lái)看，TrkA 主要表達(dá)于精母細(xì)胞中。若用 4-MC處理新出生的大鼠，TrkA 的表達(dá)規(guī)律則與成年大鼠不同[8]。此外，人們通過(guò)建立TrkA敲除小鼠模型進(jìn)一步說(shuō)明了NGF/TrkA系統(tǒng)在雄性生殖生理中發(fā)揮的重要作用。TrkA被敲除掉后，胚胎期的第14天(E14)小鼠的睪丸中的曲細(xì)精管數(shù)目顯著的低于對(duì)照組。從組織學(xué)上也能看出睪丸的發(fā)育明顯的滯后。到了胚胎期的第19天(E19)，TrkA敲除小鼠的睪丸曲細(xì)精管中的精原細(xì)胞的數(shù)目顯著減少，且曲細(xì)精管中的凋亡細(xì)胞的比例要比正常小鼠中多10倍以上[9]。然而，由于TrkA敲除小鼠出生后不久就會(huì)死亡，所以無(wú)法利用該模型分析NGF/TrkA系統(tǒng)對(duì)小鼠精子發(fā)生的影響。但是可以通過(guò)生精細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型對(duì)此進(jìn)行研究。當(dāng)用NGF連續(xù)處理生精細(xì)胞5天后，生精細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)中處于第二次減數(shù)分裂后期的精母細(xì)胞的比例會(huì)顯著增加，而精細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。但是，若用TrkA的抑制劑K252a處理后，精細(xì)胞的數(shù)量顯著增加[10]。在精子的發(fā)生過(guò)程中，間質(zhì)細(xì)胞與支持細(xì)胞均在生殖細(xì)胞的成熟、分化和精子的生成中發(fā)揮重要作用[11]。因此，NGF 及其受體 TrkA 在睪丸中各種細(xì)胞的表達(dá)及分布，說(shuō)明 NGF 有可能是通過(guò)旁分泌的方式影響著生精細(xì)胞的分化。當(dāng)用NGF處理14天后，大鼠睪丸中的支持細(xì)胞特異的雄激素結(jié)合蛋白(androgen binding protein，ABP)可顯著的提高，說(shuō)明在睪丸發(fā)育過(guò)程中ABP的作用可能受到NGF的調(diào)節(jié)[12]。在體外培養(yǎng)體系中，用10ng/mL 的NGF處理12天，可提高睪丸支持細(xì)胞的存活率，而用BDNF、NT-3和NT-4處理則沒(méi)有這種變化[13]。此外， NGF 還可以提高小鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞中類固醇激素的分泌[14]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明48小時(shí)后對(duì)照組體外培養(yǎng)的小鼠睪丸支持細(xì)胞末見(jiàn)明顯生長(zhǎng)，NGF組小鼠睪丸支持細(xì)胞3-4小時(shí)生長(zhǎng)即可以貼壁，48小時(shí)已經(jīng)長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。可知NGF可能促進(jìn)小鼠睪丸支持細(xì)胞的生長(zhǎng)。近年隨著人們對(duì)NGF的深入研究，發(fā)現(xiàn)其并不是神經(jīng)系統(tǒng)所特有的分子蛋白，NGF及其受體廣泛存在于全身各個(gè)系統(tǒng)，并且發(fā)揮作用。

近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，NGF 和 TrkA 同樣還存在于成熟的牛和人的精子中，并且在少弱精癥(oligoasthenozoospermic)患者的精液中 NGF 蛋白的含量和精子中 TrkA 的 mRNA水平均很低[15]。在牛成熟精子中，NGF 主要位于精子的頂體帽，核和尾部。若用 NGF處理2 h可以顯著的影響牛成熟精子瘦素及胰島素的分泌，并影響精子的活率和凋亡[16]。同時(shí)，NGF 還可以通過(guò) MAPK 信號(hào)通路影響倉(cāng)鼠精子的頂體反應(yīng)，且這個(gè)過(guò)程依賴于 NGF的濃度和處理的時(shí)間[15]。

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