顧加祥，尚修超，劉宏君，張乃臣，田 恒，潘俊博，楊建東*

(1.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 手外科，江蘇 揚(yáng)州225001；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州225001)

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)，不僅可促進(jìn)多種神經(jīng)元的存活與分化,而且對多種原因造成的神經(jīng)損傷具有明顯的保護(hù)作用[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)又名骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，是來源于骨髓的單胚層多能干細(xì)胞，能自我增殖。一方面，通過分泌多種細(xì)胞因子和生長因子控制造血干細(xì)胞的成熟和分化。另一方面，具有橫向分化的潛能，如：神經(jīng)細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞及肝細(xì)胞等。因其取材容易，能迅速體外培育和增殖，同時具有多向分化潛能，并且避免了倫理方面的沖突。因此，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程、細(xì)胞移植和基因治療方面有十分廣闊的前景[2,3]。

1 材料與方法

1.1 試劑

SD大鼠(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物房提供)，脂質(zhì)體(美國invitrogen) ，GDNF基因(美國abcam公司)，DAPI(福建邁新)，NSE一抗 (美國abcam)，MAP-2一抗(美國abcam公司)，免疫紅色熒光二抗(北京博奧森)，倒置顯微鏡(日本nikon)。

1.2 BMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

成年大鼠由我校動物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重180 g左右。將大鼠置于75%的酒精中消毒5 min。無菌條件下取出雙側(cè)脛骨和股骨，并剪去兩端，用5 ml注射器抽取DMEN培養(yǎng)基5 ml反復(fù)沖洗骨髓腔，將沖洗液緩慢置于離心管中,2 500 r/min離心20 min,收集中間單層細(xì)胞,PBS 沖洗2次,應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基3 ml 重新懸浮細(xì)胞,接種于6孔板內(nèi),置于室溫、5% CO2、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。24 h后更換新培養(yǎng)液去除非貼壁細(xì)胞,以后每隔3 d換液一次。當(dāng)10-12 d時，細(xì)胞生長融合達(dá)培養(yǎng)板孔90% ，用0.25%胰蛋白酶消化傳代,3-4 d傳代一次。用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。

BMSCs傳至第三代時收集細(xì)胞,PBS 洗滌2次,加入熒光標(biāo)記抗體避光4℃孵育30 min,PBS 洗滌2次。

1.3 GDNF基因脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

在轉(zhuǎn)染前一天將BMSCs細(xì)胞按5×104cells/ml接種于6孔培養(yǎng)板;脂質(zhì)體、載GDNF的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，于室溫、5%CO2、飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。分別于GDNF基因作用6 h、24 h、48 h及72 h后,在倒置相差熒光顯微鏡下觀察脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染情況。可見24 h轉(zhuǎn)染效率較佳，鏡下觀察明顯可見細(xì)胞熒光，表明轉(zhuǎn)染結(jié)果達(dá)到要求。

1.4 免疫熒光檢測

將誘導(dǎo)后的BMSCs種植在24孔板內(nèi)(板內(nèi)放置無菌玻片)，對細(xì)胞行NSE、MAP-2 免疫熒光染色檢測，一抗為兔抗NSE(1∶100)、兔抗MAP-2(1∶100)，4℃孵育過夜；二抗為生物素化羊抗兔IgG(1∶100)，室溫孵育1 h，SABC-Cy3液(1∶100)，室溫孵育30 min。NSE、MAP-2陽性細(xì)胞呈紅色熒光。

2 結(jié)果

鏡下觀察可見三代細(xì)胞形態(tài)舒展，貼壁佳，達(dá)到轉(zhuǎn)染前良好的細(xì)胞狀態(tài)。

GDNF基因脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染24小時，鏡下白光可見轉(zhuǎn)染后24小時細(xì)胞貼壁及舒展?fàn)顟B(tài)良好(圖1)，鏡下綠色熒光可見細(xì)胞熒光強(qiáng)度佳，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到誘導(dǎo)要求(圖2)。

免疫熒光檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)陽性顯示(圖3)，髓磷脂酸性蛋白2(MAP-2)高表達(dá)(圖4)。充分說明了誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)表現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞的特性。

圖1轉(zhuǎn)染后BMSCs白光 圖2 轉(zhuǎn)染后BMSCs熒光 圖3GDNF基因誘導(dǎo)后2周 圖4 GDNF基因誘導(dǎo)后2周NSE免疫熒光染色后MAP-2免疫熒光染色

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來源于中胚層的干細(xì)胞，主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，具有自我更新和增殖能力，在適宜的微環(huán)境里具有多向分化潛能[4,5]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs),作為供體細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞所無法比擬的優(yōu)點(diǎn):可以很容易地從成人體內(nèi)獲得骨髓細(xì)胞,并且對成人損害輕微;自體移植克服了使用胎兒組織所帶來的倫理和免疫學(xué)方面的問題。BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化主要通過以下通路進(jìn)行：①Wnt信號通路；②Notch信號通路；③Erk信號通路；④蛋白激酶A信號通路[6,7]。同時，microRNAs的表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用，它通過轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和表觀遺傳學(xué)水平等方式調(diào)控基因的表達(dá)，使得蛋白質(zhì)特異性表達(dá)，從而在神經(jīng)分化和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[8]。

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)對多巴胺能神經(jīng)元、運(yùn)動神經(jīng)元等多種神經(jīng)元均具有促存活及損傷保護(hù)作用，對感覺神經(jīng)元有營養(yǎng)作用，因此其可應(yīng)用于神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的治療[9,10]。

通過貼壁篩選法從成年大鼠骨髓中成功分離得到BMSCs，并通過3次傳代在體外進(jìn)行純化。GDNF基因脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，BMSCs具有神經(jīng)細(xì)胞的特有形態(tài)：胞體呈雙極或多極型，伸出較多突起和分支，形成網(wǎng)絡(luò)。

通過不同時間點(diǎn)對神經(jīng)細(xì)胞不同發(fā)育階段的蛋白表達(dá)水平的檢測，我們發(fā)現(xiàn)NSE和MAP-2依次表達(dá)，這與神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過程相符。

神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE),對維持神經(jīng)系統(tǒng)生理功能極為重要，被認(rèn)為是神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)中可見NSE表達(dá)，且含量隨著時間延長而增加[11-13]。髓磷脂酸性蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP-2)為神經(jīng)細(xì)胞骨架成分，主要在神經(jīng)元胞體、樹突、樹突棘表達(dá)，是一種調(diào)節(jié)微管蛋白組裝和動力學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子，與微管蛋白形成微管，并和其他結(jié)構(gòu)元件構(gòu)成細(xì)胞骨架成分，參與突起生長、胞漿蛋白運(yùn)輸、線粒體的軸突轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)元和突觸可塑性調(diào)節(jié)等功能，可作為神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白。實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)MAP-2的表達(dá)隨著時間的延長，其表達(dá)量逐漸增加[14,15]。

現(xiàn)今急需解決的問題是如何有效的將外源基因?qū)氚屑?xì)胞并使其穩(wěn)定表達(dá)。目前用于介導(dǎo)GDNF基因的載體很多，如慢病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體[16-18]。脂質(zhì)體用于脫氧核苷酸的介導(dǎo)已有一段時間，尚未用于GDNF基因的介導(dǎo)[19-21]。我們采用GDNF基因脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化。

雖然BMSCs可向神經(jīng)細(xì)胞分化，但BMSCs在誘導(dǎo)分化過程中仍有不足之處[22-26]：①沒有BMSCs的特異性標(biāo)記分子，而且沒有標(biāo)準(zhǔn)的分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增和鑒定的方法；②BMSCs誘導(dǎo)分化效率尚不理想，如何定向誘導(dǎo)BMSCs向單一的特定的細(xì)胞分化仍在研究之中；③BMSCs可跨胚層分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，有望成為神經(jīng)細(xì)胞替代治療的種子細(xì)胞，但誘導(dǎo)后的細(xì)胞是否具有神經(jīng)細(xì)胞的生理功能尚待進(jìn)一步研究。

同時，我們應(yīng)對BMSCs誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)是否含有神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行檢測：①該物質(zhì)是否存在于軸突末梢內(nèi);②神經(jīng)興奮時該物質(zhì)是否能釋放至突觸間隙，并且作用于突觸后膜上的特異性受體；③神經(jīng)元中是否有合成該物質(zhì)的前體和中間物，是否有合成酶和分解酶；④神經(jīng)末梢內(nèi)是否有對該物質(zhì)迅速滅活的機(jī)制系統(tǒng)；⑤該物質(zhì)作用于突觸后膜時是否能模擬神經(jīng)生理效應(yīng)；⑥該物質(zhì)是否有特異性阻斷劑。

作者簡介：顧加祥(1969-)，男，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：手足顯微外科。

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