尹耀明

(江蘇省溧陽(yáng)市婦幼保健醫(yī)院 藥劑科, 江蘇 溧陽(yáng), 213300)

慢性盆腔炎(CPID)作為臨床婦科的常見(jiàn)病，其主要特征為以腹痛、帶下、盆腔組織發(fā)生增厚、黏連以及形成盆腔包塊等[1]。慢性盆腔炎反復(fù)發(fā)作，能夠?qū)е聦m外孕、不孕以及神經(jīng)官能癥等，嚴(yán)重影響婦女健康，如何防治慢性盆腔炎始終是臨床研究的重點(diǎn)課題之一[2-3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立盆腔炎動(dòng)物模型，以免疫調(diào)節(jié)角度出發(fā)，分析桂枝茯苓膠囊對(duì)慢性盆腔炎模型大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響，旨在為臨床治療慢性盆腔炎提供參考。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)成年健康的Wistar雌性大鼠共120只作為本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，購(gòu)自于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為 SCXK(遼) 2010-000, 大鼠體質(zhì)量為(220±25) g, 鼠齡6～8周，飼養(yǎng)條件：室溫20 ℃～22 ℃, 濕度40%～70%, 標(biāo)準(zhǔn)飼料，采用自主攝食、自由飲水的方式喂養(yǎng)。常規(guī)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

IL-1β、IL-8及TNF-α的ELISA 檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)自美國(guó)ADL公司); VEGF抗體(購(gòu)自于北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；大腸桿菌及金黃色葡萄球菌(遼寧省衛(wèi)生防疫站提供)；戊巴比妥鈉(購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑公司); ELX800 酶標(biāo)儀(產(chǎn)自美國(guó) BIO-TEKS公司); CX41光學(xué)顯微鏡(產(chǎn)自日本OLYMPUS公司); HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)(產(chǎn)自武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司); BP310S 電子天平(產(chǎn)自德國(guó)Sartorius公司)；高速低溫離心機(jī)3K-30(產(chǎn)自于美國(guó)Sigma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：依據(jù)完全隨機(jī)原則，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組以及桂枝茯苓膠囊組共4組，每組30只，正常對(duì)照組組正常飼養(yǎng)，不采取任何干預(yù)措施，假手術(shù)組(開(kāi)腹后每側(cè)宮腔內(nèi)各注入0.1 mL無(wú)菌蒸餾水后關(guān)腹)，模型組及桂枝茯苓膠囊組進(jìn)行慢性盆腔炎造模。

1.3.2 建立慢性盆腔炎動(dòng)物模型：參照文獻(xiàn)[4]應(yīng)用混合細(xì)菌聯(lián)合機(jī)械損傷法，具體方法為：采取1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉劑量標(biāo)準(zhǔn)為30 mg/kg, 待麻醉效果滿意后，取仰臥位，將大鼠的頭和四肢固定在操作臺(tái)上，腹中部常規(guī)備皮、消毒， 在下腹正中作一長(zhǎng)約1cm的切口，沿腹正中線剪開(kāi)皮膚，進(jìn)入腹腔后，于膀胱后方找出并充分暴露子宮，用注射器對(duì)子宮內(nèi)膜組織造成機(jī)械損傷后，每側(cè)宮腔內(nèi)注射0.1 mL混合細(xì)菌懸液，將子宮回歸原位, 1#絲線對(duì)腹壁和皮膚進(jìn)行連續(xù)縫合，關(guān)腹，術(shù)畢。術(shù)后動(dòng)物采用常規(guī)喂養(yǎng)方式，不給予抗生素治療。

1.3.3 給藥方法：桂枝茯苓膠囊組：應(yīng)用桂枝茯苓膠囊治療，生產(chǎn)單位：江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字: Z10950005, 計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)為1.0 g/kg, 利用蒸餾水制成1 mL的懸濁液， 每日上午9時(shí)灌胃給藥，其他組同時(shí)給予1 mL生理鹽水灌胃治療。末次給藥后，采用心臟取血方法獲取5 mL血液，經(jīng)離心處理后，取上層血清放置在-30 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 子宮形態(tài)學(xué)改變：新鮮子宮組織在固定、脫水、透明及石蠟包埋處理后，制作切片，常規(guī)進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。應(yīng)用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.4.2 檢測(cè)子宮組織中VEGF表達(dá)情況：應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察VEGF陽(yáng)性細(xì)胞集中區(qū)域，利用HPIAS-1000 高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算機(jī)完全定量分析。VEGF表達(dá)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：胞漿、胞核、胞膜呈棕黃色顆粒。在相數(shù)點(diǎn)長(zhǎng)為0.832μm、統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積為4.3e+0.05的條件下,每張切片陽(yáng)性細(xì)胞比=陽(yáng)性目標(biāo)面積/統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積÷[(陰性目標(biāo)面積+陽(yáng)性目標(biāo)面積)/統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積]。

1.4.3 檢測(cè)血清中IL-1β、IL-8及TNF-α表達(dá)水平：依據(jù)ELISAkit 操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，在光密度值為450 nm處，參照標(biāo)準(zhǔn)管光密度值應(yīng)用 Cruve Expert 1.3軟件作標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-1β、IL-8、IL-10及 TNF-α濃度。

2 結(jié) 果

2.1 子宮形態(tài)學(xué)改變

正常對(duì)照組：子宮的大小及形態(tài)正常，與周?chē)M織未發(fā)生粘連，子宮內(nèi)膜未見(jiàn)充血水腫，肌纖維紋理顯示清晰，極少數(shù)腺體輕度增生。假手術(shù)組：子宮大小及形態(tài)接近正常，未見(jiàn)與周?chē)M織粘連，子宮內(nèi)膜無(wú)充血水腫，肌纖維紋理較為清晰，腺體偶有輕度增生；模型組：子宮變大，質(zhì)硬，部分大鼠可見(jiàn)宮腔積液、盆腔充血，與周?chē)M織可見(jiàn)明顯的組織粘連，部分大鼠可見(jiàn)肉芽腫，子宮組織可見(jiàn)上皮增生、鱗化，肌纖維紋理紊亂，部分腺體囊性增生，固有層腺體發(fā)生壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞；桂枝茯苓膠囊組：子宮大小及形態(tài)與正常接近，與周?chē)M織無(wú)明顯粘連，子宮內(nèi)膜輕度充血，呈增生樣改變，固有膜可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞少量散在存在。

2.2 各組子宮組織中VEGF表達(dá)水平比較

假手術(shù)組大鼠的VEGF陽(yáng)性表達(dá)水平與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05); 模型組及桂枝茯苓膠囊組子宮組織中的VEGF陽(yáng)性表達(dá)顯著高于正常組及假手術(shù)(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.3 各組血清中IL-1β、IL-8及TNF-α表達(dá)水平比較

模型組IL-1β、IL-8及TNF-α陽(yáng)性表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組及假手術(shù)組比較(P<0.01); 桂枝茯苓膠囊組IL-1β、IL-8及TNF-α陽(yáng)性表達(dá)雖略有升高，但是顯著低于模型組(P<0.01), 并且與正常對(duì)照組及假手術(shù)組相比,P>0.05, 不具有顯著性差異。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠子宮組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)比較

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-8及TNF-α表達(dá)水平比較

3 討 論

慢性盆腔炎可累及多部位，其具有發(fā)病率高，病情頑固，復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)[5]。慢性盆腔炎作為病原體感染導(dǎo)致的盆腔組織炎癥反應(yīng)，雖然并沒(méi)有直接的細(xì)菌感染證據(jù)，但是其能夠侵襲盆腔器官，導(dǎo)致局部血流障礙、組織代謝力下降，相關(guān)研究認(rèn)為其病情進(jìn)展與免疫病理?yè)p傷，炎性細(xì)胞因子異常表達(dá)密切相關(guān)[6-7]。桂枝茯苓膠囊為桂枝茯苓丸經(jīng)醇提加水提精制而成，具有活血化瘀、消癥止痛的功效，被譽(yù)為“活血化瘀第一方”。桂枝茯苓膠囊其主要藥物成分為桂枝、茯苓、芍藥、牡丹皮及桃仁，桂枝、茯苓合為君藥，能夠化氣，利濕，益心脾，健脾土，促使痰生無(wú)源；丹皮、赤芍合桃仁能夠化瘀血，清瘀熱，諸藥合用，陰陽(yáng)調(diào)和，氣血流暢，活血化瘀，消癥塊，緩疼痛?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)桂枝茯苓膠囊不僅具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜的作用，而且能夠調(diào)解免疫功能，改善微循環(huán)，目前已經(jīng)成為臨床治療CPID的常用藥物[8-9]。施慧等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)桂枝茯苓膠囊能夠降低CPID大鼠MDA、TXB2、IL-1β及TNF-α表達(dá)，上調(diào)SOD活性，提高6-keto-PGF1表達(dá)，提示桂枝茯苓膠囊能夠減輕氧自由基損傷，抑制促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，維持PGI2/TXA2平衡，從而有效治療慢性盆腔炎。本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用桂枝茯苓膠囊干預(yù)的慢性盆腔炎大鼠，不僅病理改變顯著減輕，而且IL-1β、IL-8及TNF-α等促炎性細(xì)胞因子陽(yáng)性表達(dá)顯著低于模型組，其VEGF陽(yáng)性表達(dá)顯著提高，說(shuō)明桂枝茯苓膠囊能夠通過(guò)促進(jìn)VEGF表達(dá)、降低促炎性因子表達(dá)發(fā)揮治療慢性盆腔炎的功效。

[1] 賈磊, 王希浩. 中醫(yī)藥治療慢性盆腔炎實(shí)驗(yàn)研究概述[J]. 中醫(yī)研究, 2011, 24(10): 73.

[2] 周愛(ài)香. 中西醫(yī)結(jié)合治療慢性盆腔炎臨床觀察[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 14(2): 160.

[3] 周英, 李鳳葵. 慢性盆腔炎的中醫(yī)辨證論治規(guī)律研究[J]. 云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 34(2): 48.

[4] 祝琳, 康佳麗, 李莉萍. 桂枝茯苓膠囊灌腸配合微波治療慢性盆腔炎的療效觀察[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 29(12): 37.

[5] 王小英, 林玉蘭. 中西醫(yī)結(jié)合治療慢性盆腔炎60例觀察[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 23(12): 649.

[6] 蔡雪芬, 王樟連, 陳利芳. 黃芪注射液穴位注射治療慢性盆腔炎的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2006, 35(4): 430.

[7] 谷風(fēng). 利濕化瘀法對(duì)慢性盆腔炎大鼠血清SOD、MDA影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 陜西中醫(yī), 2010, 31(4): 496.

[8] 孫蘭, 林楠, 呂耀中, 等. 桂枝茯苓膠囊對(duì)大鼠慢性盆腔炎的影響[J].中藥藥理與臨床雜志, 2013, 29(4): 21.

[9] 師偉, 劉瑞芬, 楊曉娜, 等. 桂枝茯苓膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性盆腔炎大鼠子宮組織相關(guān)炎癥因子的影響[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 28(6): 558.

[10] 施慧, 王靚, 龍子江, 等. 桂枝茯苓膠囊保留灌腸治療慢性盆腔炎的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 14(1): 11.