王 成, 郝立群

(吉林省腫瘤醫(yī)院 內(nèi)四科, 吉林 長(zhǎng)春, 130012)

手術(shù)或化療治療后，經(jīng)病理學(xué)檢查為陰性的大腸癌(CRC)患者通常會(huì)在若干年后再次復(fù)發(fā)，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞存在微轉(zhuǎn)移-難以檢測(cè)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)進(jìn)入血液，并形成新的病灶。CRC患者腫瘤細(xì)胞高表達(dá)兩種腫瘤標(biāo)志物，細(xì)胞角蛋白20(CK 20)[1]和癌胚抗原(CEA)[2]。進(jìn)入外周血的CTCs也表達(dá)CK 20和CEA。CK20于1990年被發(fā)現(xiàn)，只局限性表達(dá)在胃腸上皮細(xì)胞，而在正常淋巴組織、血液組織、骨髓組織中不表達(dá)，在非上皮組織中檢測(cè)到CK 20提示存在當(dāng)有大腸癌細(xì)胞存在時(shí)。CK20是檢測(cè)腸癌微轉(zhuǎn)移的既特異又敏感的良好標(biāo)志物。CEA是一種常用的大腸癌診斷標(biāo)志物，但準(zhǔn)確性只有50%左右。使用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[3]結(jié)合熒光定量PCR(RTFQ PCR)方法檢測(cè)血液中的CK20及CEA mRNA陽(yáng)性表達(dá)率，旨在建立一種非侵襲性、高效的檢測(cè)CRC微轉(zhuǎn)移的方法?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取吉林省腫瘤醫(yī)院2011年11月—2013年11月收治的經(jīng)病理檢查確診的大腸癌患者58例(CRC組)，其中結(jié)腸癌20例，直腸癌38例。男32例，女26例；年齡41～67歲，中位年齡53歲; Ducke′s分期為: A期9例，B期16例，C期13例，D期20例。同時(shí)選取24例非惡性病變腹部手術(shù)患者作為對(duì)照。其中男14例，女10例；年齡44～75歲，中位年齡56歲。2組患者性別、年齡等一般資料無(wú)顯著性差異(P>0.05), 具有可比性。

1.2 標(biāo)本采集

所有患者于治療前于上肢淺靜脈取血，棄去注射器抽取的前5 mL血液以減少標(biāo)本被皮膚細(xì)胞污染可能。常規(guī)肝素抗凝，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，加入1 mL Trizol保存于-20 ℃。

1.3 主要試劑和儀器

Trizol Reagent RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis System cDNA合成試劑盒(M-MLV)、RNase抑制劑(美國(guó)Promega公司)，焦炭酸二磷脂(DEPC)(美國(guó)Sigma公司), dNTP mixture(南京天為生物有限公司), 2×PCR Mix [0.1 U Taq Polymerase/μL, 500 μmol/L dNTP each, 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3), 100 mmol/L KCl, 3 mmol/L MgCl2]、Oligo(dT)、DNase I (RNase-free)(美國(guó)Fermentas公司)，ROX Reference Dye(美國(guó)羅氏公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.4 總RNA提取鑒定及cDNA合成

嚴(yán)格按照RNA抽提試劑盒說(shuō)明書操作提取總RNA，純化后以DNA標(biāo)準(zhǔn)品為參照進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取產(chǎn)物，上樣量3 μg。隨后取RNA樣品10 μL, Oligo(dT) 2 μL(混勻，70 ℃孵育5 min, 立即冰水浴，稍離心), 5×M-MLV Buffer 4 μL, 無(wú)核酸酶水2 μL, 2種dNTP mixture(10 mmol/L each) 共2 μL, RNase inhibitor 1 μL, 共21 μL。50 ℃孵育50 min, 然后85 ℃反應(yīng)5 min, 立即置于冰上。離心收集產(chǎn)物。加入1 μL RNase抑制劑, 37 ℃孵育20 min。cDNA合成以后置于-20 ℃保存。

1.5 RTFQ PCR反應(yīng)

1.5.1 引物：引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。CK20引物上游序列5′-CAGACACACGGTGAACTATGG-3′, 下游5′-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG-3′, 擴(kuò)增長(zhǎng)度為370 bp; CEA上游引物5′-TTATTGGCAGGTCAGGAGAAGAGCC-3′, 下游引物5′-CGCGACTTGATGTCCATGAGCCGCTGGTAC-3′, 擴(kuò)增長(zhǎng)度745bp; β-actin上游引物5′-TCATCACCATTGGCAATGAG-3′, 下游引物5′-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3′, 擴(kuò)增長(zhǎng)度154 bp。

1.5.2 反應(yīng)體系：反應(yīng)體系中加入SYBR Premix Ex Taq (2) 12.5 μL, 上下游引物(各10 μmol/L)混合液1 μL, Rox reference dye 0.5 μL，cDNA樣品1 μL, 無(wú)菌水10 μL。聚合酶活化95 ℃ 30 s, PCR擴(kuò)增95 ℃ 5 s/60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。各RTFQ PCR產(chǎn)物做融解曲線分析。使用7300 system software v1.3.1，2-ΔΔCt法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)產(chǎn)物的熒光擴(kuò)增曲線計(jì)算外周血CTCs檢出率。

1.6 觀察指標(biāo)

觀察RTFQ PCR產(chǎn)物熒光擴(kuò)增曲線。若無(wú)內(nèi)參β-actin擴(kuò)增曲線則判為實(shí)驗(yàn)失敗，僅有1條β-actin擴(kuò)增曲線則判為陰性。具有β-actin、CK20及CEA擴(kuò)增曲線判為CTCs強(qiáng)陽(yáng)性，僅有β-actin及CEA擴(kuò)增曲線則判為弱陽(yáng)性。CTCs陽(yáng)性檢出率=CK20+CEA mRNA陽(yáng)性率=(強(qiáng)陽(yáng)性+弱陽(yáng)性)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA鑒定

如圖1所示，瓊脂糖凝膠快速電泳顯示所提取的總RNA具有清晰的28S、18S條帶，這表明所提總RNA純度高、無(wú)降解，質(zhì)量能夠滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 總RNA瓊脂糖電泳圖

2.2 各組CK20和CEA mRNA陽(yáng)性率情況

PCR結(jié)果所示無(wú)1例PCR擴(kuò)增失敗。對(duì)照組外周血幾乎未檢測(cè)到2種蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。CRC組Ducke's A期、B期、C期、D期2種蛋白mRNA陽(yáng)性率分別為11.1%(1/9)、62.5%(10/16)、76.9%(10/13)及100%(20/20)，總陽(yáng)性率為93.1%(54/58)。

2.3 CTCs陽(yáng)性檢出率與臨床病理參數(shù)關(guān)系

CTCs陽(yáng)性檢出率與臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05), 但與分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 外周血CTCs陽(yáng)性檢出率與CRC臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

近年來(lái)，CTCs檢測(cè)作為一項(xiàng)獨(dú)立的高危因素用于預(yù)測(cè)腫瘤患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后，通過檢測(cè)存在于外周血的微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞[4]，提示風(fēng)險(xiǎn)的意義更大。而血液循環(huán)中腫瘤細(xì)胞數(shù)量極少，檢測(cè)十分困難，形態(tài)學(xué)檢查、流式細(xì)胞術(shù)或傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)方法敏感性太低，免疫化學(xué)技術(shù)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[5]。RTFQ PCR是一種新定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過熒光標(biāo)記的特異性探針檢測(cè)目的基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)CTCs，熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成同步，具有高度特異和敏感性，定量結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)性低，多重RTFQ PCR聯(lián)合監(jiān)測(cè)多個(gè)腫瘤標(biāo)志物目前正廣泛用于瘤基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷[6]。研究證實(shí)RTFQ PCR法檢測(cè)血液中大腸癌細(xì)胞的靈敏度為百萬(wàn)分之一，即106個(gè)血細(xì)胞中混入1～10個(gè)腫瘤細(xì)胞就可以檢出[7]。

研究認(rèn)為，臨床轉(zhuǎn)移一般由微轉(zhuǎn)移發(fā)展而來(lái)，微轉(zhuǎn)移的瘤細(xì)胞灶常以單個(gè)細(xì)胞或微小細(xì)胞團(tuán)形成，通過淋巴系統(tǒng)、血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至其他組織器官。CRC患者早期常無(wú)明顯癥狀，部分大腸癌患者確診時(shí)已到晚期，多數(shù)患者最終死于局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)，嚴(yán)重影響治療效果和預(yù)后[8]。大腸癌外周血微轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，即使在癌癥早期，患者外周血循環(huán)癌細(xì)胞陽(yáng)性率已達(dá)24%[9]。隨著疾病的進(jìn)展，CTCs檢出率進(jìn)一步升高，提示動(dòng)態(tài)觀察外周血中特異性高的CRC診斷標(biāo)志物有助于判斷疾病的惡性程度及預(yù)后。

細(xì)胞角蛋白20(CK 20)在組織分化、腫瘤分型、檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移中日漸受到重視[10]。CK是上皮細(xì)胞發(fā)生、分化、成熟過程中逐漸形成的，是所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞骨架中間絲之一。不同于CK 18、CK 19等，CK 20僅表達(dá)于CRC腫瘤細(xì)胞[11]，而正常血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胃腸道和泌尿道黏膜細(xì)胞、和淋巴細(xì)胞等均不表達(dá)。因此，應(yīng)用RTFQ PCR檢測(cè)外周血、淋巴結(jié)、骨髓中有無(wú)CK20的表達(dá)，可作為有效檢測(cè)CTCs的指標(biāo)。CEA mRNA是細(xì)胞惡變時(shí)有關(guān)腫瘤基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，CEA常應(yīng)用于胃腸道消化系統(tǒng)腫瘤的輔助診斷和療效的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)[12]。約82%CRC及40%以上的乳腺等腫瘤細(xì)胞及幾乎所有的上皮細(xì)胞包括上皮性腫瘤細(xì)胞，而在正常非上皮細(xì)胞中則不能檢出，細(xì)胞之外不能存在游離的CEA mRNA。CEA雖然不是腫瘤特異性抗原，但CEA mRNA已成為分泌性腫瘤的標(biāo)志基因，在外周血中，若能檢測(cè)到CEA mRNA的表達(dá)，即可推斷有表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞已發(fā)生轉(zhuǎn)移或易位。同時(shí)CEA mRNA可作為結(jié)直腸癌患者療效的輔助檢測(cè)[13]。

多重RT-PCR聯(lián)合檢測(cè)外周血CK20及CEA mRNA表達(dá)，可特異性檢測(cè)出CRC治療后陽(yáng)性CTCs數(shù)，判斷是否發(fā)生微轉(zhuǎn)移及CRC患者預(yù)后[14]。本研究發(fā)現(xiàn)CRC患者外周血中CK20及CEA mRNA陽(yáng)性表達(dá)顯著高于對(duì)照組，這與秦海春[15]等、姜立新[10]等研究結(jié)果一致，提示CTCs存在。CK 20及CEA mRNA陽(yáng)性表達(dá)率與Ducke′s分期及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與腫瘤細(xì)胞分化程度并不相關(guān)，提示Ducke′s分期高及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，CTCs檢出率高。結(jié)果初步提示多重PCR聯(lián)合監(jiān)測(cè)2種特異性CRC腫瘤標(biāo)志物，有助于高效準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)大腸癌治療的療效以及判斷預(yù)后。關(guān)于少量循環(huán)癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)移灶的形成或復(fù)發(fā)之間的關(guān)系是否明確，有待于加大樣本，并進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪研究。

[1] 葉欣, 李毅, 侯剛, 等. 大腸癌患者淋巴結(jié)細(xì)胞角蛋白-20 mRNA基因表達(dá)的臨床意義[J]. 中華腫瘤雜志, 2002, 24(3): 261.

[2] 趙富鋒. 大腸癌患者腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)及其診斷價(jià)值[J]. 醫(yī)學(xué)信息, 2011, 24(1): 9.

[3] Tsouma A, Aggeli C, Lembessis P, et al. Multiplex RT-PCR-based detections of CEA, CK20 and EGFR in colorectal cancer patients[J]. World J Gastroenterol, 2010, 16(47): 5965.

[4] Sonoda H, Tani T. Clinical significance of molecular diagnosis for gastric cancer lymph node micrometastasis[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(38): 13728.

[5] Cho W C. Emerging techniques in molecular detection of circulating tumor cells[J]. Expert Rev Mol Diagn, 2014, 14(2): 131.

[6] Vaiopoulos A G, Kostakis I D, Gkioka E, et al. Detection of circulating tumor cells in colorectal and gastric cancer using a multiplex PCR assay[J]. Anticancer Res, 2014, 34(6): 3083.

[7] Samija I, Lukac J, Mubrin M K, et al. Detection of cytokeratin-20-positive cells in preoperative and postoperative blood samples from colorectal cancer patients by real-time RT-PCR[J]. Int J Biol Markers, 2013, 28(2): 174.

[8] 黃毅捷, 袁建明. 結(jié)腸直腸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移及其I臨床意義[J]. 外科理論與實(shí)踐, 2009, 14(2): 245.

[9] Soster M, Juris R, Bonacchi S, et al. Targeted dual-color silica nanoparticles provide univocal identification of micrometastases in preclinical models of colorectal cancer[J]. Int J Nanomedicine, 2012, 7: 4797.

[10] 姜立新, 張翼飛, 鄭海濤, 等. CK20檢測(cè)散發(fā)性結(jié)直腸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的臨床意義[J]. 中華胃腸外科雜志, 2009, 12(6): 636.

[11] 馬杰, 岳欣. 惡性腫瘤的微轉(zhuǎn)移和細(xì)胞角蛋白檢測(cè)的應(yīng)用意義[J]. 中國(guó)綜合臨床, 2008, 24(1): 93.

[12] Nagayasu K, Komiyama H, Ishiyama S, et al. Investigation of free cancer cells in peripheral blood using CEA mRNA expression in perioperative colorectal cancer patients[J]. Mol Clin Oncol, 2013, 1(4): 668.

[13] Wallin U, Rothenberger D, Lowry A, et al. CEA-a predictor for pathologic complete response after neoadjuvant therapy for rectal cancer[J]. Dis Colon Rectum, 2013, 56(7): 859.

[14] Liu Y, Qian J, Feng J G, et al. Detection of circulating tumor cells in peripheral blood of colorectal cancer patients without distant organ metastases[J]. Cell Oncol (Dordr), 2013, 36(1): 43.

[15] 秦海春, 劉俊, 杜廷義, 等. 大腸癌手術(shù)前后外周血CEA蛋白、CEA mRNA的變化及臨床意義[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2012, 32(3): 499.