侯文潔，張 亮，李梓源，丁紅梓，周秋云*(.南京市胸科醫(yī)院藥學(xué)部，南京 009；.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南京 66)

頭孢吡肟 (cefepime) 為第四代廣譜頭孢菌素，具有較強(qiáng)的抗革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌作用[1-2]。目前，頭孢吡肟在敏感菌所致的下呼吸道感染治療中應(yīng)用廣泛[3-4]。因此，探索頭孢吡肟在肺組織中的藥動(dòng)學(xué)特性，對(duì)指導(dǎo)臨床合理使用有一定的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道，摸索并建立了簡(jiǎn)單的方法來(lái)測(cè)定頭孢吡肟在肺組織中的濃度。研究小鼠進(jìn)行單次尾靜脈注射后肺內(nèi)頭孢吡肟的藥動(dòng)學(xué)特性，為臨床上其治療下呼吸道感染提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開(kāi)展頭孢吡肟的藥動(dòng)學(xué)和生物利用度研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 島津 LC-20AB高效液相色譜儀(檢測(cè)器為SPD-M20A，日本島津公司)；組織勻漿機(jī)(Bioprap-24.杭州奧盛)；高速離心機(jī)(TG1650-ws，上海盧湘儀)；全自動(dòng)渦旋儀(MX-S，大龍興利)。

1.2試藥 頭孢吡肟對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：130524-200502，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于83.0%)；茶堿對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100121-201104，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98.0% )；鹽酸頭孢吡肟(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：3H00316，規(guī)格：1.0 g)；甲醇、乙腈、三氯乙酸(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)；其他試劑為分析純(南京化學(xué)試劑有限公司)。

1.3動(dòng)物 ICR小鼠，18～22 g(SPF級(jí)，雌雄各半，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2008-0016，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Waters Xselect-HSS T3(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-20 mmol·L-1醋酸銨溶液(冰醋酸調(diào)pH至5)=9∶11；流速：1 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2溶液的配制

2.2.1對(duì)照品溶液的配制 精密稱取頭孢吡肟對(duì)照品，置于10 mL量瓶中，用超純水溶解定容后配成1.0 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取茶堿對(duì)照品，用甲醇溶解后稀釋成0.1 mg·mL-1的溶液，備用。

2.3給藥方案與樣品采集 ICR小鼠，78只，隨機(jī)分為13 組，每組禁食 12 h后，靜脈注射給藥1 000 mg·kg-1。分別于給藥后 0.08，0.16，0.30，0.45，0.60，0.85，1.17，1.5，2，3，4，6和8 h取肺組織，-20 ℃冰箱保存。

2.4樣品處理 取空白小鼠肺臟，吸水紙吸干后用剪刀剪碎，分析天平稱質(zhì)量，加3倍量的生理鹽水并用勻漿器制成均質(zhì)的肺組織勻漿液。取300 μL加入1.5 mL離心管中，再加入質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)茶堿溶液20 μL，加入0.1 mg·mL-1的三氯乙酸溶液150 μL，渦旋2 min，以16 000 r · min-1離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1方法專屬性 取6只ICR小鼠( 雌雄各半) 的空白肺組織勻漿液各2份，每份300 μL，1份置于2.5 mL離心管中，不加內(nèi)標(biāo)，按2.4項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣20 μL獲得空白色譜圖(圖1A)；另1份空白肺組織中加入一定質(zhì)量濃度的頭孢吡肟標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)茶堿溶液，同法操作后獲得相應(yīng)的色譜圖(圖1B)，頭孢吡肟對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為6.4和8.7 min； 取給藥后的小鼠10 min時(shí)間段的肺組織樣品，同法操作后獲得相應(yīng)的色譜圖(圖1C) 。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下的頭孢吡肟和內(nèi)標(biāo)物分離良好，肺組織中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)樣品測(cè)定不產(chǎn)生干擾。

圖1 鹽酸頭孢吡肟肺組織樣品HPLC圖

2.5.2線性范圍和定量限 精密量取300 μL空白肺組織勻漿液，加入一定量的對(duì)照品儲(chǔ)備液及質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)茶堿溶液20 μL，渦旋混勻后，配制成頭孢吡肟肺組織勻漿液，標(biāo)準(zhǔn)模擬肺組織勻漿液工作曲線，質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，1，2，10和20 μg· mL-1。按2.4項(xiàng)下進(jìn)行處理，進(jìn)樣20 μL，HPLC分析。以肺組織中頭孢吡肟質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、頭孢吡肟及內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，用最小二乘法回歸運(yùn)算，得到直線回歸方程：

Y=0.175 9X+0.021 6(r=0.999 2)

結(jié)果表明，在 0.1～20 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

取肺組織終質(zhì)量濃度為0.1 μg·mL-1的質(zhì)控樣品5份，按2.4項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均值為0.085 μg·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)差為0.004，RSD為4.167%，定量下限為0.1 μg·mL-1，滿足方法學(xué)樣品的測(cè)定要求。

2.5.3精密度 精密量取300 μL空白肺組織勻漿液，加入一定量的對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)茶堿溶液20 μL，渦旋混勻后，配制成低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本，頭孢吡肟肺組織質(zhì)量濃度分別為0.2，2和20 μg·mL-1。按2.4項(xiàng)下進(jìn)行處理，進(jìn)樣量20 μL。每個(gè)質(zhì)量濃度分別測(cè)5份樣品，連續(xù)測(cè)3 d，考察日內(nèi)及日間精密度，其RSD為2.05%～13.18%。

2.5.4回收率 精密量取300 μL空白肺組織勻漿液，加入一定量的對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)茶堿溶液20 μL，渦旋混勻后，配制成低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本，頭孢吡肟肺組織質(zhì)量濃度分別為0.2，2和20 μg·mL-1，按2.4項(xiàng)下進(jìn)行處理，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)5次，進(jìn)樣量20 μL。求出頭孢吡肟與內(nèi)標(biāo)的峰面積比，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算頭孢吡肟的質(zhì)量濃度以及方法回收率。該方法回收率分別為95.22%，98.74%和100.32%，RSD分別為5.76%，5.32%，4.28%。以標(biāo)準(zhǔn)肺組織樣品中提取后測(cè)得的峰面積與對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液所測(cè)得的峰面積之比計(jì)算提取回收率，其值分別為80.29%，83.97%和86.21%，RSD分別為8.76%，5.48%，2.94%。

2.5.5穩(wěn)定性 配制頭孢吡肟在肺組織勻漿液中高、中、低質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品，質(zhì)量濃度分別為0.2，2和20 μg·mL-1?？疾炱湓谑覝胤胖?4 h后的穩(wěn)定性。其值穩(wěn)定，RSD為3.73%～11.87%；樣品在-20 ℃冰箱中保存3 d穩(wěn)定，RSD為1.18%～11.45%；樣品反復(fù)凍融解凍2次后穩(wěn)定，RSD為1.68%～13.14%。

2.5.6小鼠肺內(nèi)藥動(dòng)學(xué) 按2.3項(xiàng)下處理并測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織中的藥物濃度(表1)，得鹽酸頭孢吡肟在肺組織中藥時(shí)曲線圖(圖2)。用DAS3.1藥代動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)肺組織藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，鹽酸頭孢吡肟的肺內(nèi)藥動(dòng)學(xué)符合一室模型，以統(tǒng)計(jì)矩方法求得相應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(表2)。

表1 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織中的藥物濃度

圖2 鹽酸頭孢吡肟肺組織中藥物濃度-時(shí)間曲線

表2 鹽酸頭孢吡肟在肺中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在建立色譜條件時(shí)，參考了已有文獻(xiàn)[5-6]，對(duì)流動(dòng)相磷酸鹽和醋酸銨進(jìn)行了系統(tǒng)適用性比較，兩者的色譜行為相差不大，最終選擇了對(duì)色譜柱損害相對(duì)較小的醋酸銨。本實(shí)驗(yàn)在選擇沉淀劑時(shí)，比較了體積分?jǐn)?shù)30%，20%和10%三氯乙酸，通過(guò)色譜圖發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)30%和20%三氯乙酸的雜質(zhì)峰多于體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸，推測(cè)可能是體積分?jǐn)?shù)較高的三氯乙酸本身有可能會(huì)引入雜質(zhì)。體積分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸已經(jīng)可以沉淀完全。準(zhǔn)確進(jìn)行生物樣品含量測(cè)定時(shí)，選擇合適的內(nèi)標(biāo)最為關(guān)鍵。在類似研究中，有文獻(xiàn)報(bào)道以茶堿、對(duì)乙酰氨基酚、頭孢他啶、阿司匹林等作為生物樣品檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)[5-7]，其中茶堿的色譜行為與頭孢吡肟最為相近且不干擾其測(cè)定，因此本實(shí)驗(yàn)選用茶堿作為內(nèi)標(biāo)。

研究表明，在常規(guī)給藥劑量范圍內(nèi)，頭孢吡肟在人體內(nèi)的代謝符合線性動(dòng)力學(xué)的過(guò)程，未見(jiàn)藥物在體內(nèi)有明顯蓄積的現(xiàn)象[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，頭孢吡肟在小鼠肺內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)符合一室模型，藥物能夠快速進(jìn)入肺組織，肺內(nèi)半衰期較短，臨床上可以通過(guò)增加給藥頻次或持續(xù)外周靜脈給藥以期達(dá)到更好的療效。

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