張繼業(yè)，杜 蕊，劉婷婷，楊范莉，童 華(.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 7006，.陜西省眼科研究所，西安市眼科醫(yī)院，西安市第一醫(yī)院，西安 7000；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安 7006)

新疆紫草(Arnebiaeuchroma(Royle) Johnst)是紫草科軟紫草屬植物，也稱新疆軟紫草。作為傳統(tǒng)中藥，新疆紫草具有多種生物學(xué)活性，如抑菌、傷口愈合、抗病毒、抗炎、抗癌、抗腫瘤等[1-2]，在臨床上應(yīng)用廣泛。從紫草中分離提取出以紫草素為代表的萘醌類成分為其主要活性成分。同時紫草素也是良好的天然色素，已廣泛用于食品和化妝品中。

目前報(bào)道的紫草素提取方法有溶劑萃取法、減壓蒸餾法、超聲提取法、微波提取法、超臨界萃取法等[3-5]。但受成本和設(shè)備限制，可應(yīng)用于大量生產(chǎn)的最優(yōu)提取方法仍是傳統(tǒng)的溶劑萃取法。而有研究發(fā)現(xiàn)，采用不同的溶劑提取紫草素會使得紫草提取物中紫草素含量差別較大，紫草素含量差異直接導(dǎo)致藥理活性不同[6]。本文以紫草素的提取率為評價(jià)指標(biāo)，選用4種常用的提取溶劑(石油醚、乙醇、氯仿、堿液)提取新疆紫草，篩選出最佳的紫草素提取方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 AY120電子分析天平(日本島津公司)；LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津公司)；HWS-5A恒溫水浴鍋(上海百典儀器有限公司)；GENIUS 16K臺式高速離心機(jī)(長沙市鑫奧儀器儀表有限公司)。

1.2試藥 左旋紫草素對照品，購自南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司；紫草飲片購自同仁堂陜西分公司，并由西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰教授鑒定為新疆紫草；石油醚、氯仿、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、甲酸均為分析純；乙腈為色譜純(天津市科密歐試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1提取液的制備 取已干燥至恒質(zhì)量的新疆紫草，粉碎過篩，精密稱取5.0 g，分別用45 mL石油醚、氯仿、乙醇、10 g·L-1氫氧化鈉堿液浸漬，在室溫避光條件下，攪拌30 min，過濾，藥材殘?jiān)貜?fù)提取1次，合并兩次濾液，得提取液，避光冷藏保存，待用。

2.2色譜條件 Waters XTerra?RP18色譜柱(150 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動相采用二元體系，A為含0.5 mL·L-1甲酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋? min時A相為95%，30 min時B相升至100%，并維持10 min；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為276 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為50 μL。

2.3對照品儲備液制備 精密稱取左旋紫草素對照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得200 μg·mL-1紫草素對照品儲備液。

2.4供試品溶液制備 精密量取1.0 mL紫草素提取液(石油醚提取液、氯仿提取液、乙醇提取液)，用乙醇稀釋至15 mL，以12 000 r·min-1離心10 min，取上清液作為供試品溶液。精密量取堿液提取液1.0 mL，加入1 mol·L-1鹽酸溶液1.0 mL，待沉淀析出完全，加乙醇稀釋至15 mL，以12 000 r·min-1離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.5專屬性 取提取物樣品按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖，見圖1，紫草素色譜峰峰形良好，無雜峰干擾，保留時間為19.63 min，該方法具有良好的專屬性。

2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取相應(yīng)體積紫草素對照品儲備液，置于量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制質(zhì)量濃度為12，10，8，6，4，2 和0.2 μg·mL-1對照品溶液。分別取上述溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。以各對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，得紫草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=75 870.975 2X+2 564.526 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。表明紫草素在0.2 ～12 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

圖1 HPLC圖

2.7精密度 精密量取6 μg·mL-1對照品溶液50 μL，按2.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果紫草素RSD為1.82%，表明本法精密度良好。

2.8穩(wěn)定性 精密量取1 mL紫草素乙醇提取液，乙醇稀釋至10 mL作為供試品溶液，將供試品溶液置于室溫(25 ℃)條件下不避光保存。分別于0，2，4，6，8，10和12 h進(jìn)樣50 μL進(jìn)行分析，紫草素峰面積RSD為8.51%，表明在室溫不避光條件下，測定方法穩(wěn)定性不能滿足要求。將同一供試品溶液避光冷藏條件下保存，按上述方法測定，結(jié)果紫草素峰面積RSD為2.93%。證明在避光冷藏下，紫草素的測定結(jié)果穩(wěn)定性良好，故在測定過程中樣品應(yīng)注意避光和冷藏。

2.9含量測定 按2.4項(xiàng)下的方法制備4種提取液供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紫草素的含量后換算成提取率。紫草素在堿液、氯仿、乙醇和石油醚中的提取率分別為0.996%±0.07%，0.785%±0.065%，0.982%±0.061%和0.568%±0.054%(n=3)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在3種有機(jī)溶劑中紫草素提取率差別較大(乙醇>氯仿>石油醚)，原因在于紫草素在3種有機(jī)溶劑中的溶解度不同。在室溫條件下，在該投料量與溶劑比下，紫草素在乙醇中的溶解度最大，提取量最大。

4種提取溶劑堿液提取紫草素提取率最大。紫草中萘醌類成分雖為脂溶性成分，但紫草素及其衍生物可在堿液中成鹽，溶解度增加，利于萘醌類成分的提取。堿液提取與有機(jī)溶劑提取相比，堿液提取時，提取物中強(qiáng)極性雜質(zhì)成分較多，而酸沉再經(jīng)乙醇萃取后，可去除一些強(qiáng)極性雜質(zhì)，提取物中雜質(zhì)含量減少。

有研究表明，紫草素具有光不穩(wěn)定性，同時由于萘醌類結(jié)構(gòu)中羥基存在使得紫草素也易被氧化。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)獲知，長時間置于空氣中，紫草素的含量會下降。本實(shí)驗(yàn)在避光條件下，選擇相對較短的提取時間(30 min)重復(fù)2次提取進(jìn)行分析。

綜上所述，堿提酸沉后經(jīng)乙醇萃取為最適的提取方法，能夠在提高提取物中紫草素含量的同時，降低提取物中雜質(zhì)的含量。采用堿液提取能夠有效節(jié)省有機(jī)溶劑的用量，減少成本，同時降低環(huán)境污染。

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