白音夫，周雪梅，周長鳳，李德良，馮國慶，任小偉(.內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)研究所，呼和浩特 0000；.內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，呼和浩特 00070)

蒙古山蘿卜ScabiosacomosaFisch的花卉，為蒙醫(yī)藥治療肝病的藥材。蒙醫(yī)認(rèn)為，該藥微甘、性涼，入肝、肺經(jīng)，有清肝明目、祛火消積功效，用于肝熱癥、肝中毒、肝性消瘦、黃疸性肝炎，該藥與其他藥材配伍，可治療多種肝臟疾病[1]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該藥可以提高小鼠血清溶菌酶、巨噬細(xì)胞溶菌酶、巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶和巨噬細(xì)胞殺傷李斯特桿菌的活性；降低大腸桿菌內(nèi)毒素的毒性；有解熱、消炎作用；抗氧化、防治肝損傷與肝纖維化作用[2-5]。由于主要成分不明確，在蒙藥藥材標(biāo)準(zhǔn)中暫無測定方法[6]。本文對其主要成分分離、鑒定，在此基礎(chǔ)上建立含量測定方法[7]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；TJ-912型色譜分析平臺(太極計(jì)算機(jī)公司)；IN-180型柱溫箱(上海英泰科技研究所)；SH6150D超聲波清洗器(上海昆山儀器有限公司)；電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 綠原酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑為分析純。研究用蒙古山蘿卜由呼和浩特市藥材站提供；測定樣品于2007年9月～2011年9月中旬采集于內(nèi)蒙不同山區(qū)，采集的樣品及時(shí)干燥，避光保存。

2 方法與結(jié)果

2.1結(jié)構(gòu)分析

2.1.1提取 取蒙古山蘿卜粉碎過60目篩，稱取100 g，加800 mL石油醚(60～90 ℃沸程)回流提取1 h；藥渣晾干，加水1 000 mL回流1 h，提取液趁熱濾過，濾液放冷，加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%，攪拌，靜置24 h;取上清液，濾過，減壓回收乙醇并濃縮成清膏，低溫干燥，粉碎成細(xì)粉；加200 mL乙酸乙酯超聲處理，濾過，取濾液，蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL使其溶解，備用。

2.1.2薄層的制備與樣品的分離 取硅膠G，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%羧甲基纖維素鈉，照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)制成(1.5 mm×200 mm×200 mm)的薄層板，備用。展開劑：乙酸乙酯-甲酸-水(7∶2∶3)上層液。線性點(diǎn)樣，展距140 mm，晾干，置于紫外燈(356 nm)下切割產(chǎn)生熒光區(qū)域的硅膠，用甲醇提取，過濾，蒸干甲醇，得白色結(jié)晶。

2.1.3鑒定 UVλmxaMeOHnm 330，244，220。IRvmaxKBrcm-13 400(-OH)，1 708(C=O)，1 660，1 640，1 620，985，835。MS：m/z354(M+)，180，163，130。HNMRδ6.25(1H，d，J=15.9 Hz，H-α)，6.82(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.97(1H，dd，J1=8.2 Hz，J2=2.1 Hz，H=67)，7.21(1H，d，J=2.1 Hz，H-2)，7.52(1H，d，J=15.9 Hz，H-β)。Rf、HPLC-tR值與綠原酸相同，UV、IRv圖譜與綠原酸一致，確定結(jié)晶為綠原酸。

2.2含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱Kromasil C18(200 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-3 mL·L-1磷酸溶液(12∶88)；流速：1 mL·min-1；溫度：30 ℃；檢測波長328 nm；進(jìn)樣量10 μL，在此條件下待測組分可達(dá)到基線分離[1]。樣品中綠原酸與其他組分有較好的分離，見圖1。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的綠原酸對照品適量，置于棕色量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 mL含0.28 mg綠原酸溶液，作為對照品溶液。分別精密量取綠原酸對照品溶液0.25，0.5，1，2，3，4和5 mL，置于10 mL量瓶內(nèi)，用甲醇稀釋至刻度，按上述色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果，在質(zhì)量濃度7～140 μg·mL-1范圍內(nèi)以峰面積(A)與對照品質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行回歸，其線性關(guān)系良好?；貧w方程：A=5 452.5+7 008.4C，r=0.999 0。

2.2.3供試品溶液制備 精密稱取蒙古山蘿卜藥材0.2 g，置于50 mL具塞磨口瓶內(nèi)，加甲醇10 mL，稱質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，稱質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用，即得。

圖1 HPLC圖

2.2.4精密度實(shí)驗(yàn) 精密抽取對照品溶液10 μL，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得綠原酸峰面積的RSD為0.41%。

2.2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8和12 h進(jìn)樣，以綠原酸峰面積值計(jì)算RSD為0.71%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取樣品6份，每份約0.2 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件進(jìn)行分析，并計(jì)算含量，綠原酸含量的平均值(n=6)為3.20 mg·g-1，RSD為1.33%。

2.2.7回收率實(shí)驗(yàn) 取上述含量的同批樣品6份，每份約0.12 g，置于50 mL量瓶中，依次分別加入0.1 mL(1 mL含綠原酸4.20 mg)對照品溶液，揮去溶劑，按供試品溶液的制備操作，測定含量，計(jì)算回收率。綠原酸平均回收率為101.2%，RSD為2.6%。

2.2.8樣品測定 精密稱蒙古山蘿卜藥材，按以上確定的方法制成供試品溶液，測定樣品中的含量，不同產(chǎn)地樣品中綠原酸含量分別為：呼和浩特蠻漢山0.242%，呼和浩特大青山0.278%，呼和浩特圣水梁0.360%，烏蘭察布輝騰梁0.431%，呼倫貝爾紅花爾基林場0.164%。

3 討論

本文通過制備薄層分離蒙古山蘿卜成分，經(jīng)鑒定為綠原酸，在此基礎(chǔ)上建立HPLC法測定藥材中綠原酸含量的方法。對內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地的蒙古山蘿卜中的綠原酸含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地藥材含量差別較大，可見氣候條件對藥材成分的影響。由于蒙古山蘿卜是蒙醫(yī)藥治療肝性疾病的特色藥材，長期以來無含量測定方法，本實(shí)驗(yàn)研究為蒙古山蘿卜建立含量測定標(biāo)準(zhǔn)，填補(bǔ)了空白，可為深入研究開發(fā)蒙古山蘿卜提供參考數(shù)據(jù)。

蒙古山蘿卜成分已有研究報(bào)道，但成分中未見綠原酸報(bào)道[8]。綠原酸具有多種活性，是藥品、保健品原料。根據(jù)藥材中綠原酸含量高低可基本確定藥材品質(zhì)和療效。

用本法測定蒙古山蘿卜中的綠原酸含量，其特點(diǎn)是樣品預(yù)處理簡單，回收率穩(wěn)定，重復(fù)性好，可作為藥材的質(zhì)量評價(jià)方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 內(nèi)蒙古衛(wèi)生局.內(nèi)蒙古中草藥[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，1972: 158-159.

[2] 田國才，劉朝，沈敬華，等. 蒙古山蘿卜總黃酮激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的動態(tài)研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1986，6(2): 107-111.

[3] 于潔，李希賢.蒙藥蘭盆花總黃酮對家兔外周血白細(xì)胞的影響[J].內(nèi)蒙古藥學(xué)，1986，4(1): 27-29.

[4] 白音夫，李銳峰，顧維章.蒙古山蘿卜總黃酮解熱、消炎、鎮(zhèn)痛作用研究[J].內(nèi)蒙古藥學(xué)，1987，5(1): 43-45.

[5] 武桂枝，白音夫，常亮. 蒙古山蘿卜酸對免疫性肝炎的保護(hù)及免疫調(diào)節(jié)[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2007， 13(4): 55-56.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn):蒙藥分冊[S]. 1998: 52.

[7] 劉放，陳冰冰，吳小平.HPLC法測定菊花中綠原酸的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2010，25(5): 350-352.

[8] 王乃利，白玉霞，樊崢嶸，等.蒙古山蘿卜活性成分的研究[J].中草藥，1989，20(6): 7-9.