毛耀南，王和林，魏潤新，錢南萍(江蘇省泰州市人民醫(yī)院，泰州 225300)

硒是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和碘甲狀腺脫碘酶(ID)的重要成分，參與體內(nèi)多種酶的催化反應(yīng)。硒通過調(diào)節(jié)GSH-Px的活性，阻斷體內(nèi)脂質(zhì)過氧化過程，達(dá)到對膜的保護，從而使細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜的結(jié)構(gòu)和功能不受氧化物和過氧自由基的損害，防治多種生化紊亂所致的病變，維持生物體的正常生理功能[1-2]。人體內(nèi)缺硒， 谷胱甘肽 ( GS Hpx)活性下降， 清除過氧化物和自由基的能力降低， 因而脂質(zhì)過氧化物和自由基增多。由于血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞易受自由基的攻擊， 而造成血管損傷， 促進腦血管病的發(fā)生。

1973年WHO專家委員會宣布，硒是人體生理必需的微量元素之一，在生理代謝中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。有明確的實驗數(shù)據(jù)顯示，缺硒會導(dǎo)致心腦血管病、糖尿病、帕金森病、肝病、癌癥等10余種疾病的高發(fā) 。由于硒具備預(yù)防、治療多種疾病的功效，近年來，含硒藥物已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者研究、開發(fā)的熱點。目前市場上有許多含硒藥品、富硒保健品、富硒食品、富硒農(nóng)副產(chǎn)品等，一系列含硒的產(chǎn)品由于技術(shù)水平差異，也沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，一般是因企業(yè)宣傳力度及銷售策略的不同而吸引大眾購買，因而消費者對這些富硒產(chǎn)品的了解、使用程度也不同，對患者來說，在選擇上比較盲目。鑒于硒元素對癌癥、心腦血管病等慢性病防治方面的作用，我們結(jié)合臨床的需求，從醫(yī)院制劑的角度研制了復(fù)方硒口服液，已經(jīng)試用于臨床，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 AF-640原子熒光光譜儀，硒空心陰極燈，電子天平，PHS-3C型精密pH計，電熱板，玻璃儀器等。

1.2試藥 硒酸酯多糖(含硒量為2%，天賜福生物工程公司)；硝酸、高氯酸、鹽酸(均為優(yōu)級純)；氫氧化鈉、硼氫化鈉、鐵氰化鉀(均為分析純)；硒對照品(光譜純)；復(fù)方硒口服液(本院制劑室自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1復(fù)方硒口服液的制備方法

2.1.1處方組成 硒酸酯多糖0.02 g，維生素B10.1 g，維生素B60.03 g，泛酸鈣0.01 g，乙醇 50 mL，苯甲酸鈉3 g，純化水加至1 000 mL。

2.1.2制備方法 精密稱取維生素B1、維生素B6、泛酸鈣與硒酸酯多糖，加入適量的純化水溶解后，再將事先溶解好的苯甲酸鈉水溶液加入，最后添加純化水至全量，混勻，即得。

2.2鑒別

2.2.1性狀 本口服液為無色澄清液體，溶液無沉淀、渾濁、霉敗、異臭、變色。

2.2.2維生素B1取樣品2 mL，加氫氧化鈉試液3 mL，加鐵氰化鉀試液0.5 mL與正丁醇5 mL，強力振搖2 min，放置分層，上層為醇層，顯強烈藍(lán)色熒光。加酸使其成酸性，熒光即消失，再加堿使其成堿性，熒光復(fù)現(xiàn)。

2.2.3維生素B6取樣品2 mL，加磷鉬酸飽和液2～3 滴，加氨試液使成堿性，加氯亞氨基2，6-二氯醌乙醇溶液(1∶200)1～2滴，溶液即顯綠色。

2.2.4鈣鹽 取樣品2 mL，加草酸銨試液2～3滴，即發(fā)生白色沉淀；分離，沉淀不溶于醋酸，溶于鹽酸。

2.2.5pH值 應(yīng)為4.0～5.0。

2.2.6其他 均符合《中國藥典》2010年版口服溶液劑項下的規(guī)定[5]。

2.3含量測定

2.3.1試劑的配制 硝酸與高氯酸混合液(1∶1)：取硝酸(1.42 g·mL-1)與高氯酸(1.68 g·mL-1)各適量，等體積混合即得。

鹽酸溶液(1.19 g·mL-1)。

鹽酸溶液(5∶95)：取25 mL鹽酸，用純水稀釋至500 mL。

鹽酸(1∶1)：取25 mL鹽酸，用純水稀釋至50 mL。

氫氧化鈉溶液(2 g·L-1)：稱取1 g氫氧化鈉，溶于純水中，稀釋至500 mL。

硼氫化鈉溶液(NaBH4)(20 g·L-1)：稱取硼氫化鈉10.0 g，溶于配好的氫氧化鈉溶液500 mL，混勻。

鐵氰化鉀溶液(100 g·L-1)：稱取10.0 g鐵氰化鉀，溶于100 mL蒸餾水中，混勻。

硒標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(100.0 μg·mL-1)：精密稱取100.0 mg硒(光譜純)，溶于少量硝酸中，加2 mL高氯酸(優(yōu)級純)，置于沸水浴中加熱3～4 h，冷卻后再加8.4 mL鹽酸，再置于沸水浴中煮2 min，用純水定容至1 000 mL。

硒標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(1.0 μg·mL-1)：取5.0 mL硒標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于500 mL量瓶中，用純水定容至刻度。

硒標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.10 μg·mL-1)：取10.0 mL硒標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，置于100 mL量瓶中，用純水定容至刻度。

2.3.2測定條件 PMT電壓：270 V；HCL主陰極電流：40 mA；載氣流量：800 mL·min-1；原子化器溫度：200 ℃；采樣泵速：100 r·min-1；注入泵速：100 r·min-1。讀數(shù)時間：20 s；延時時間：2 s；進樣體積：0.5 mL；讀數(shù)方式：峰面積。測定譜圖見圖1。

圖1 硒的標(biāo)準(zhǔn)譜圖

2.3.3樣品的處理 取25 mL樣品加入2.5 mL硝酸-高氯酸混合液，在電熱板上加熱消解。當(dāng)溶液冒有白煙時，取下冷卻，再加入2.5 mL鹽酸溶液(1∶1)，繼續(xù)加熱至溶液冒有白煙時，已完全將六價硒還原成四價硒[6]。取下冷卻，用純水轉(zhuǎn)移至比色管中，用純水定容至10 mL。同時做空白實驗。

2.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 吸取硒標(biāo)準(zhǔn)使用液0，1.00，2.00，4.00，8.00和12.00 mL，分別置于量瓶中，分別加入5 mL鹽酸(1.19 g·mL-1)、5 mL鐵氰化鉀(100 g·L-1)，用純水定容至50 mL，混勻，使硒的質(zhì)量濃度分別為0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0和120.0 μg·L-1。用AF-640原子熒光光譜儀測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程：Y=69 925X+151.25，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。結(jié)果表明，硒的質(zhì)量濃度在10.0～120.0 μg·L-1范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.5精密度實驗 精密稱取處理后的樣品2.00 mL，按上述方法，重復(fù)進行5次，測定硒的含量，結(jié)果RSD為1.25%(n=5)，符合定量分析的要求。

2.3.6重復(fù)性實驗 取同一樣品5份，照樣品含量測定方法測定含量，平均測定5次，結(jié)果平均含量為0.374 mg·L-1，RSD為2.0%(n=5)。

2.3.7回收率實驗 取空白樣品5份，加入10.0～120.0 μg·L-1的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，照樣品含量測定方法測定，平均回收率為100.5%，RSD為1.42%(n=5)，結(jié)果見表1。

表1 回收率實驗結(jié)果

2.3.8樣品含量測定 取處理后的樣品2.00 mL，置于量瓶中，加入5 mL鹽酸(1.19 g·mL-1)、5 mL鐵氰化鉀(100 g·L-1)，用純水定容至50 mL，混勻。用AF-640原子熒光光譜儀測定樣品的熒光強度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由回歸方程計算樣品消化液中硒元素的質(zhì)量濃度(n=5)，含量以百分標(biāo)示量表示。測定3批樣品，平均含量為94.17%，RSD均<2.0%。

3 討論

硒(Se)在人體內(nèi)具有重要的生理作用，微量元素硒參與甲狀腺激素生物合成過程[7]，人體內(nèi)缺硒，谷胱甘肽 ( GS Hpx)活性下降，清除過氧化物和自由基的能力降低，因而脂質(zhì)過氧化物和自由基增多。由于血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞易受自由基的攻擊，造成血管的損傷，促進腦血管病的發(fā)生，臨床資料表明，腦血栓患者頭發(fā)硒含量下降。維生素B1是糖代謝所需輔酶的重要組成成分，維生素B6為多種酶的輔基，參與氨基酸及脂肪的代謝，泛酸鈣為輔酶A的組分，參與糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝。硒酸酯多糖、維生素B1、維生素B6均為水溶性，適宜制成液體制劑，復(fù)方硒口服液服用方便，口感好。

測定硒含量的方法很多，如熒光法、 原子吸收光譜法、 原子熒光法、 等離子體發(fā)射光譜法、分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法等，原子熒光光譜法為我國制定的測定硒的標(biāo)準(zhǔn)方法。原子熒光光譜法測定硒含量的原理[8]：在鹽酸介質(zhì)中，以硼氫化鈉(NaBH4)作為還原劑，將硒還原成硒化氫(SeH4)，由載氣(氬氣)帶入原子化器中進行原子化，在硒特制空心陰極燈照射下，基態(tài)硒原子被激發(fā)至高能態(tài)，在去活化回到基態(tài)時，發(fā)射出特征波長的熒光，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其熒光強度與硒含量成正比。該檢測方法測得的結(jié)果準(zhǔn)確，方法特異性強，抗離子的干擾性強，取樣少，操作簡便，精密度高。

硒在水中主要是以無機的六價硒、四價硒、負(fù)二價硒及某些有機硒的形式存在，也可能有微量的硒附著在固體顆粒物上并懸浮在水中，因此，在反應(yīng)前應(yīng)先對樣品進行處理[9]。在實驗過程中，樣品的處理多采用混合酸的濕消解法，以使低于或高于四價無機硒轉(zhuǎn)化為四價硒，實驗中用硝酸-高氯酸混合液進行消解，鹽酸為介質(zhì)，且鹽酸濃度越高，干擾越小，以完全將六價硒還原成四價硒[10]。

樣品在消解過程中，硒熒光強度會隨四價硒的不斷形成而逐漸增強，到達(dá)終點時為最大值。終點之后，若繼續(xù)加熱，硒會隨著溶液溫度的升高而開始揮發(fā)。因此，要準(zhǔn)確地判別消解終點，減少實驗誤差。我們所建立的原子熒光光譜法測定口服液中硒含量的方法靈敏、精確、簡便、快速， 值得推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王以明，汪模輝，張勇，等.硒和硒化物的藥理及藥效學(xué)研究[J]．藥學(xué)進展，2003，27(2): 96-99.

[2] 肖穎歆，劉秀芳，徐漢生．有機硒藥物的研究進展及開發(fā)應(yīng)用前景[J]．中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1997，14(5): 1-5.

[3] 王廣珠，牛作霞.微量元素硒的毒性研究進展[J].西北藥學(xué)雜志，2010，25(3): 237-238.

[4] 徐天嬌，袁秉祥，劉勇．胰島素與硒聯(lián)合應(yīng)用治療糖尿病大鼠的可行性分析[J]．西北藥學(xué)雜志，2012，27(3): 231-233.

[5] 國家藥典委員會.中國藥典2010年版[S].二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010: 附錄15.

[6] 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會. GB/ T5009.93-2003，食品中硒的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[7] 鄭億，王玉華，楊姣．硒聯(lián)合比索洛爾治療自身免疫性甲狀腺疾病合并陣發(fā)性房顫的臨床觀察[J].中國藥房，2013，24(24): 2250-2252.

[8] 中華人民共和國衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司.生活飲用水衛(wèi)生規(guī)范[S].2006.

[9] 朱杰民，馮梅.熒光法測硒前處理的幾點問題[J].廣東衛(wèi)生防疫，1996，22(3): 9-10.

[10]鄒曉春，李紅華，林春曉，等.氫化物發(fā)生-原子吸收光譜法測定水中硒的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，1999，9(1): 21-23.