白青子,王 威,張宏森

(1.黑龍江科技大學(xué) 環(huán)境與化工學(xué)院，哈爾濱 150022; 2.哈藥集團(tuán)制藥總廠，哈爾濱 150080)

離子化方式對(duì)于頭孢曲松質(zhì)譜裂解方式的影響

白青子1,王 威2,張宏森1

(1.黑龍江科技大學(xué) 環(huán)境與化工學(xué)院，哈爾濱 150022; 2.哈藥集團(tuán)制藥總廠，哈爾濱 150080)

離子化方式不但是頭孢曲松質(zhì)譜檢測(cè)的前提條件，而且對(duì)于頭孢曲松質(zhì)譜裂解方式具有重要的影響。研究表明：在正離子檢測(cè)模式下，存在C—S鍵斷裂、四元環(huán)開環(huán)應(yīng)和四元環(huán)脫去羰基三種裂解方式，離子化方式對(duì)于碎片峰的種類和豐度都有重要的影響。通過(guò)對(duì)于不同離子化方式的研究證實(shí)C—S鍵斷裂是最主要的裂解方式，其碎片離子峰(m/z:396)可作為頭孢曲松的特征離子峰。在負(fù)離子檢測(cè)模式下，僅有一種羧基脫去CO2的裂解方式，與正離子模式下截然不同。

頭孢曲松；裂解方式；離子化方式

0 引 言

頭孢曲松是第三代半合成頭孢菌素，是典型的β-內(nèi)酰胺類抗生素。因其具有長(zhǎng)效和廣譜的特點(diǎn)，作為抗感染藥物被廣泛應(yīng)用于臨床[1-2]。伴隨著質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，質(zhì)譜分析方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于頭孢曲松藥物代謝物、構(gòu)效關(guān)系、穩(wěn)定性以及質(zhì)量控制等研究領(lǐng)域[3-4]。然而目前對(duì)于頭孢曲松質(zhì)譜裂解方式的研究，尤其是離子化方式對(duì)于裂解方式研究相對(duì)較少。

眾所周知，質(zhì)譜是對(duì)于離子的檢測(cè)，分子離子裂解后會(huì)生成兩個(gè)以上的碎片，而這些碎片中通常只有一個(gè)碎片帶有電荷，只有這個(gè)帶有電荷的碎片才能被檢測(cè)到。離子化方式直接決定了分子所帶電荷的種類和性質(zhì)，進(jìn)而影響到質(zhì)譜的檢測(cè)結(jié)果。因此，離子化不但是質(zhì)譜檢測(cè)的前提條件，而且對(duì)于研究頭孢曲松在不同環(huán)境下的化學(xué)穩(wěn)定性具有重要的指導(dǎo)意義。前期研究結(jié)果表明[5-6]：不同的離子化方式對(duì)于化合物的裂解方式會(huì)產(chǎn)生不同的影響，而且離子化方式不但影響生成離子峰的種類，還影響離子峰的豐度。頭孢曲松因其分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)易于質(zhì)子相結(jié)合的N原子，即在正離子檢測(cè)模式下可發(fā)生多種離子化方式。羧基的存在可以發(fā)生在負(fù)離子檢測(cè)模式下的離子化反應(yīng)。頭孢曲松多種離子化方式的存在增加了質(zhì)譜解析的難度，同時(shí)也提供了更多的反映頭孢曲松結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的譜圖信息。

本文通過(guò)對(duì)于正離子和負(fù)離子檢測(cè)模式下，相應(yīng)譜圖的解析，研究了不同離子化方式對(duì)于頭孢曲松裂解生成碎片的種類和豐度的影響，為頭孢曲松質(zhì)譜分析和構(gòu)效關(guān)系研究奠定了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

6310液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；頭孢曲松(哈藥集團(tuán)制藥總廠)；甲醇(美國(guó)TEDIA農(nóng)殘純)；高純水(美國(guó)honeywell)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

色譜柱：Agilent Zorbax(30×2.1 mm, SB-C18, 3.5 μm)；流動(dòng)相:甲醇∶水為70∶30(V/V);流速：0.3 mL /min;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量3 μL;柱溫40 ℃。離子源：ESI；Dry Temp:325 ℃；Nebulizer 30.10 psi；Dry Gas:8.98 L/min;碰撞氣：氦氣;加熱氣：氮?dú)狻?/p>

1.3 樣品制備

通過(guò)液相色譜對(duì)于樣品進(jìn)行分離，一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)[M+H]+為m/e：555和[M+H]+為m/e：553，確認(rèn)頭孢曲松分子離子峰。

2 結(jié) 果

2.1 頭孢曲松特征分析

頭孢曲松分子結(jié)構(gòu)見圖1，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是由 7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)母核、硫代三嗪雜環(huán)和氨噻肟側(cè)鏈構(gòu)成。其頭孢曲松分子中7-ACA母核和氨噻肟側(cè)鏈連接后形成了較大共軛體系，該部分結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。7-ACA母核與硫代三嗪雜環(huán)中兩個(gè)部位化學(xué)結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定：由于C原子和S原子在原子半徑、電負(fù)性等性質(zhì)方面存在較大差異，所以C—S鍵易于斷裂；另外由于四元環(huán)張力的作用，四元環(huán)易于開環(huán)[7]。從頭孢曲松結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，不難看出C—S鍵斷裂和四元環(huán)開環(huán)應(yīng)是質(zhì)譜裂解的主要方式。

頭孢曲松分子中含有8個(gè)N原子，理論上，在分子中每個(gè)外層帶有孤對(duì)電子的雜原子都可能與質(zhì)子結(jié)合，生成分子離子[M+H]+，因此即使在同一個(gè)檢測(cè)條件下，生成[M+H]+可能包含多種結(jié)構(gòu)。在負(fù)離子檢測(cè)模式下，分子中只有羧基中的H+易于失去生成帶有負(fù)電荷的分子離子，因此[M-H]-結(jié)構(gòu)只有一種[8]。

圖1 頭孢曲松結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of Ceftriaxone

圖2 頭孢曲松分子離子[M+H]+電噴霧串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS2 spectra of ions of Ceftriaxone [M+H]+

2.2 m/z:396裂解方式解析

在正離子檢測(cè)模式下(圖2)，質(zhì)核比為396的離子峰豐度最高，這表明在整個(gè)分子離子化后母核與硫代三嗪雜環(huán)相連接的C—S鍵斷裂是主要的裂解方式，這與化學(xué)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。質(zhì)譜檢測(cè)的結(jié)果除了與其相應(yīng)的化學(xué)鍵性質(zhì)有關(guān)外，還與化學(xué)鍵的位置有關(guān)。母核與硫代三嗪雜環(huán)相連接的C—S鍵斷開后分子離子裂解為兩個(gè)獨(dú)立的碎片，m/z:396碎片易于檢測(cè)。而六元環(huán)中的C—S鍵處于六元環(huán)中，即使其中一個(gè)化學(xué)鍵斷裂也不會(huì)分解成為兩個(gè)獨(dú)立的碎片，質(zhì)譜檢測(cè)中也不會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的離子峰。m/z:396的碎片峰豐度最大，由于該化學(xué)鍵易于斷裂及分子離子化過(guò)程中質(zhì)子與1～5號(hào)N原子中任何一個(gè)N原子結(jié)合，都可以生成m/z:396的離子峰。相對(duì)于其它碎片其可與質(zhì)子結(jié)合的位點(diǎn)最多，因此該離子峰豐度最高。裂解方式如下：

2.3 m/z:241裂解方式解析

m/z:241的離子峰說(shuō)明發(fā)生了代爾斯-奧爾德(Diels-Alder)反應(yīng)逆反應(yīng)，β-內(nèi)酰胺四元環(huán)開環(huán)，這是β-內(nèi)酰胺類化合物常見的斷裂方式[9-10]。開環(huán)后生成的兩個(gè)碎片的質(zhì)量數(shù)分別為240和314，如果質(zhì)子與1～4號(hào)N原子相結(jié)合檢測(cè)到的碎片離子峰的核質(zhì)比為241，與5～8號(hào)N原子相結(jié)合檢測(cè)到的碎片離子峰的核質(zhì)比為315。然而圖2中并沒有發(fā)現(xiàn)m/z:315的離子峰。這說(shuō)明m/z:315的碎片離子不可能穩(wěn)定存在。因此，在四元環(huán)開環(huán)的同時(shí)必定會(huì)發(fā)生C—S鍵容易斷裂。

m/z:396的離子峰豐度最大，表明在C—S鍵斷裂而四元環(huán)可以穩(wěn)定存在；而m/z:315的離子峰并不存在，表明四元環(huán)開環(huán)的同時(shí)必定會(huì)發(fā)生C—S鍵斷裂。因此四元環(huán)穩(wěn)定性高于C—S鍵。需要強(qiáng)調(diào)的是盡管m/z:396的離子峰豐度大于m/z:241的離子峰，但不能簡(jiǎn)單地?fù)?jù)此推斷四元環(huán)穩(wěn)定性高于C—S鍵。因?yàn)殡x子峰豐度是對(duì)于相應(yīng)離子數(shù)量的反映， m/z:396離子中可與質(zhì)子結(jié)合的位點(diǎn)多于m/z:241離子，即使發(fā)生C—S鍵斷裂和四元環(huán)開環(huán)的m/z:396分子離子數(shù)量相同，C—S鍵斷裂生成的離子碎片(m/z:396)的豐度也會(huì)大于四元環(huán)開環(huán)化生成的離子碎片(m/z:241)的豐度。裂解方式如下：

2.4 m/z:324和m/z:241裂解方式解析

脫去CO2是頭孢、青霉素類化合物通常的裂解方式，裂解的機(jī)理為羧基中的質(zhì)子進(jìn)攻羧基相連六元環(huán)中的碳原子，脫去CO2，而四元環(huán)脫去羰基在頭孢氨芐、頭孢拉定、阿莫西林等母核沒有與其它官能團(tuán)通過(guò)C—S鍵相連接的孢、青霉素類化合物的質(zhì)譜檢測(cè)中被發(fā)現(xiàn)，表明C—S鍵對(duì)于母核的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)產(chǎn)生影響。質(zhì)子與1～5號(hào)N原子相結(jié)合會(huì)生成m/z:324離子峰，質(zhì)子與1號(hào)N原子相結(jié)合才會(huì)生成m/z:277離子峰，相對(duì)而言m/z:277碎片離子峰豐度較小。裂解方式如下：

2.5 m/z:509裂解方式解析

負(fù)離子模式下，僅能檢測(cè)到脫去CO2，并沒有發(fā)現(xiàn)其它裂解方式(圖3)。前期研究中，筆者通過(guò)量子化學(xué)理論計(jì)算發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在負(fù)離子模式下，脫去CO2的同時(shí)六元環(huán)中的S原子與四元環(huán)相連的化學(xué)鍵斷裂，降低了四元環(huán)的張力，導(dǎo)致四元環(huán)不易斷裂[8]。檢測(cè)中沒有發(fā)現(xiàn)正離子模式下最主要的C—S鍵斷裂后的碎片離子。這表明在不同離子模式下,分子離子中C—S鍵的質(zhì)譜性質(zhì)發(fā)生了改變，進(jìn)而表現(xiàn)出與正離子模式下完全不同的裂解方式。

圖3 頭孢曲松分子離子[M-H]-電噴霧串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS2 spectra of ions of Ceftriaxone [M-H]-

3 結(jié) 論

在正離子檢測(cè)模式下，C—S鍵斷裂和四元環(huán)開環(huán)應(yīng)是質(zhì)譜裂解的主要方式，四元環(huán)穩(wěn)定性高于C—S鍵。由于C—S鍵斷易于斷裂，而且相對(duì)于其它碎片其可與質(zhì)子結(jié)合的位點(diǎn)最多，因此m/z:396的碎片峰豐度最大，可以將該離子峰作為頭孢曲松的特征離子峰。四元環(huán)除通常開環(huán)裂解外，還會(huì)脫去羰基。

在負(fù)離子檢測(cè)模式下，僅脫去CO2，表現(xiàn)出了與正離子模式下完全不同的裂解方式。通過(guò)與分子結(jié)構(gòu)分析相比，中性結(jié)構(gòu)性質(zhì)與在正離子檢測(cè)模式下的裂解方式較為接近，而與負(fù)離子的裂解方式相差甚遠(yuǎn)，這說(shuō)明羧酸中的質(zhì)子對(duì)于頭孢曲松的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)會(huì)產(chǎn)生重要的影響。

[1]McCloskey R V. Clinical and bacteriologic efficacy of ceftriaxone in the United States[J]. Am J Med.,1984,77: 97-103.

[2]Severin G, Carol J K, Yer L, et al. Comparison of Neisseria gonorrhoeae MICs obtained by Etest and agar dilution for ceftriaxone, cefpodoxime, cefixime and azithromycin[J]. Journal of Microbiological Methods,2013,95:379-380.

[3]Paul R, Hong F, Ellinor T, et al. Comparison of MALDI-TOF MS and VITEK 2 system for laboratory diagnosis of Granulicatella and Abiotrophia species causing invasive infections[J].Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2013,77:216-219.

[4]王 威，張宏森，郭世恩. 去乙?；^孢噻肟質(zhì)譜裂解方式和化學(xué)穩(wěn)定性[J].黑龍江大學(xué)工程學(xué)報(bào).2012,4(3):33-37.

[5]許慶軒，張宏森，張 鋼，等.電噴霧電離源中炎琥寧分子離子結(jié)構(gòu)的量子理論研究[A]; 2010年全國(guó)質(zhì)譜大會(huì)暨第三屆世界華人質(zhì)譜研討會(huì)論文集[C].長(zhǎng)春：中國(guó)物理學(xué)會(huì)，2010：297-299.

[6]寧志強(qiáng)，李 猛，張宏森，等. 氨芐西林質(zhì)譜解析及其離子化方式研究[J]. 化學(xué)與黏合,2013,5(35):34-35.

[7]張宏森，楊學(xué)舜，張 鋼.青霉素和阿莫西林的電子結(jié)構(gòu)及化學(xué)穩(wěn)定性[J].黑龍江科技學(xué)院學(xué)報(bào),2012,22(1),17-22.

[8]張宏森，魏立國(guó)，宋微娜，等. 應(yīng)用密度泛函理論研究舒坦電噴霧質(zhì)譜行為[J].黑龍江科技學(xué)院學(xué)報(bào),2013,3(23),246-250.

[9]Case A F,Cryer C，Ominde E M A.Mass spectrometry ofβ-lactam antibiotics with special reference to ionization by fast atom bombardment(FAB)[J].Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,1989,7(10), 1121-1157.

[10]張宏森，周 揚(yáng).電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法研究阿莫西林的裂解方式[J].中國(guó)藥房. 2010, 2(29): 2 762-2 764.

Effects of ionization pattern on fragmentation pathways of ceftriaxone

BAI Qing-Zi1,WANG Wei2,ZHANG Hong-Sen1

(1.School of Environment and Chemical Engineering, Heilongjiang University of Science and Technology, Harbin 150022,China; 2.Harbin Pharmaceutical Group Pharmaceutical General Factory Harbin 150080, China)

Ionization pattern is not only prerequisites of ceftriaxone in mass spectrometry, but also have an important influence on fragmentation pathways of ceftriaxone. The results indicate that ceftriaxone has three different fragmentation pathways of concluding the C—S Bond cleavage, β-lactam ring opening and carbonyl dissociation from β-lactam ring in cation detection mode, whose abundance and species of daughter ion peaks are influenced by the ionization pattern. C—S Bond cleavage is the main way of cracking, whose daughter ion peak (m/z:396) is characteristic ion peaks. In anion detection mode, ceftriaxone only one fragmentation pathway is that CO2dissociation from carboxyl.

Ceftriaxone; fragmentation pathways; ionization pattern

10.13524/j.2095-008x.2014.01.008

2014-01-16

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(E201329)，黑龍江省高等教育學(xué)會(huì) “十二五”教育科學(xué)規(guī)劃項(xiàng)目(HGJXH C110919)

白青子( 1965- ) , 女, 黑龍江樺川人, 教授, 研究方向：煤利用化學(xué)、物理有機(jī)化學(xué)，E-mail: 15604515455@163.com。

R917

A

2095-008X(2014)01-0036-05