苗 苗,王繼華，楊雪辰，陳黛慈，杜 雪

(哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025)

氨氮降解菌的分離、鑒定及降解效果初步研究

苗 苗,王繼華*，楊雪辰，陳黛慈，杜 雪

(哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025)

以(NH4)2SO4為唯一氮源的培養(yǎng)基中，從活性污泥中分離篩選出8株具有氨氮降解能力的菌株，根據(jù)各菌株之間降解率及生長情況的比較，從中篩選出1株對氨氮降解效果較為明顯的菌株NX3，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理特性初步鑒定其為芽孢桿菌屬(Bacillus)，分別測定了在不同的氨氮初始濃度、pH值、溫度下菌株NX3對培養(yǎng)基中氨氮的降解效果，實驗結(jié)果表明在初始氨氮質(zhì)量濃度300 mg/L、pH值7.0、溫度30 ℃時，該菌株對氨氮降解效果較好，降解率為45.53%。

活性污泥；氨氮降解菌；降解效果

氨氮是水相環(huán)境中氮的主要形態(tài)，是造成水體富營養(yǎng)化的主要污染物，氨氮的含量是衡量污水污染程度的一個重要指標。2011年監(jiān)測的26個重點湖庫中，包括滇池、密云水庫、千島湖和石門水庫等，其主要污染指標為氨氮、化學(xué)需氧量和生化五日需氧量，許多湖泊處于不同程度的富營養(yǎng)化狀態(tài)[1]。海洋局召開2012年海洋環(huán)境公報新聞發(fā)布會指出，全海域共發(fā)現(xiàn)赤潮73次，累計面積 7 971 km2。赤潮發(fā)現(xiàn)次數(shù)為近5 a最多。因此，水污染已經(jīng)成為一個迫在眉睫的問題，雖然目前我國在水污染防治方面做了很多工作，但是氮素仍是造成水污染的主要原因之一，近年來，國內(nèi)外對氨氮廢水處理方面開展了較多研究。其中生物脫氮技術(shù)備受關(guān)注，生物脫氮是利用從自然界中獲得的有益微生物降低氨氮，生物脫氮以其無污染、經(jīng)濟和安全等優(yōu)點被認為是目前最經(jīng)濟有效、最有前途的水體除氮方法，相關(guān)研究也備受重視[2-3]。氨氮降解菌是生物脫氮技術(shù)的關(guān)鍵，因此本文從活性污泥中分離篩選出1株具有較好氨氮降解能力的菌株，研究了初始氨氮的質(zhì)量濃度、pH值、溫度對菌株氨氮降解效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

污泥：本實驗所用菌種是從哈爾濱某污水處理廠活性污泥中篩選分離得到的。

LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，水定容至1 000 mL，pH 值7.0(LB固體培養(yǎng)基為加2%瓊脂)；篩選培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g，(NH4)2SO42.0 g，NaCl 1.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH值7.2～7.4，水定容至1 000 mL；分離培養(yǎng)基：篩選培養(yǎng)基加2%瓊脂；選擇培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g，(NH4)2SO40.225 g，NaCl 1.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，pH 值7.2～7.4，水定容至1 000 mL(初始氨氮質(zhì)量濃度約為50 mg/L) ；馴化培養(yǎng)基：在篩選培養(yǎng)基氨氮濃度基礎(chǔ)上，不斷提高氨氮濃度；模擬氨氮污水：(NH4)2SO40.47 g，NaC1 1.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，微量鹽1 mL[4]，水定容至1 000 mL(模擬氨氮污水中氨氮的初始質(zhì)量濃度為100 mg/L)。

菌懸液的制備：將至少經(jīng)過2次連續(xù)活化的菌株接種到裝有葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基100 mL的三角瓶中，并在紫外可見分光光度計420 nm波長處測定其吸光度，用葡萄糖蛋白胨液體調(diào)整質(zhì)量濃度，使其 OD420= 0.3, 作為菌懸液[5-6]。

1.2 方法

1.2.1 氨氮降解菌的分離與篩選

菌株的分離和純化。取5 g活性污泥加入裝有45 mL無菌水的內(nèi)置玻璃珠的錐形瓶中稀釋混勻，振蕩培養(yǎng)1 h，使菌膠團充分打散，從中取0.1 mL菌液經(jīng)梯度稀釋涂布于LB培養(yǎng)基平板上，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，在平板上挑選出不同形態(tài)的單菌落編號并反復(fù)劃線進行多次分離純化，直至得到純培養(yǎng)物，最后將純化后的各菌株轉(zhuǎn)至斜面保存。

氨氮降解菌的篩選與馴化。將純化所得各菌株接種至篩選培養(yǎng)基，置37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)5～7 d后，從中選取渾濁度相對較高的作為初篩試驗菌，取各初篩試驗菌液0.1 mL，分別涂布至分離培養(yǎng)基中，將分離出的各初篩試驗菌接種至馴化培養(yǎng)基，對初篩菌進行不斷馴化，最終得到試驗菌株。

1.2.2 氨氮降解菌的生長曲線測定

將菌株接種到選擇培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，在紫外可見分光光度計600 nm波長下測定其光密度(OD)值，并繪制光密度(OD)值與培養(yǎng)時間的關(guān)系曲線。

1.2.3 環(huán)境因素對氨氮降解菌的降解效果的影響

將菌種分別接種至裝有40 mL篩選培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，分別在不同溫度(25、30、35、40、45 ℃)、不同pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)和不同氨氮初始濃度(50、100、200、300、400 mg/L)條件下進行單因素試驗，測定培養(yǎng)基中殘余氨氮質(zhì)量濃度，計算氨氮的降解率，確定反應(yīng)的溫度、pH值、氨氮初始濃度對菌株降解氨氮效果的影響。

1.2.4 降解效果的測定方法

吸取10 mL菌懸液，2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，再用10 mL生理鹽水洗滌沉淀，混勻，再次離心，如此重復(fù)3次，以除去菌種活化過程中產(chǎn)生的氨氮[7]。用10 mL生理鹽水清洗沉淀，最后制成氨氮降解菌種液，按10%的接種量將菌種液接入裝有40 mL選擇培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，于120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h后，經(jīng)2 000 r/min 離心10 min，取上清液測殘余氨氮濃度并與未接種菌株的空白培養(yǎng)基作對比，測定培養(yǎng)液中氨態(tài)氮含量[8]，計算出氨氮降解率。

氨氮的測定: 采用納氏試劑分光光度法[9]進行。

1.2.5 氨氮降解菌株NX3的初步鑒定

氨氮降解菌NX3經(jīng)細胞形態(tài)和個體菌落形態(tài)的觀察、生長特征及生理生化特征，具體參照文獻[10-11]進行初步鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮降解菌的分離與篩選結(jié)果

從哈爾濱某污水處理廠二沉池采集的污泥，經(jīng)富集、分離、純化，共獲得26株菌。將純化所得26株菌經(jīng)篩選與馴化后，最終得到8株菌，編號分別為：NX3、NX6、NX10-1、NX11-1、NX11-2、NX13-1、NX13-2、NX24。8株菌的主要特征見表1。將這8株菌按10%的接種量，接入到模擬氨氮污水中，于37 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24～48 h后，計算8株菌的氨氮降解率，結(jié)果見圖1。并測定這8株菌在以(NH4)2SO4為唯一氮源的無機鹽培養(yǎng)基中的生長曲線，結(jié)果見圖2。最后通過8株菌的降解率結(jié)果及在以(NH4)2SO4為唯一氮源的無機鹽培養(yǎng)基中的生長情況，綜合比較選擇出1株在篩選培養(yǎng)基中生長速度較快、相對氨氮降解率較高的NX3菌株進一步試驗。

表1 8株氨氮降解菌的主要特征

圖1 8株菌的氨氮降解率Fig.1 Degradation rate of eight bacterias

圖2 8株菌的生長曲線Fig.2 Growth curve of eight bacterias

為進一步提高NX3菌株降解氨氮的能力，從處理溫度、反應(yīng)的pH值及初始氨氮質(zhì)量濃度3個方面的環(huán)境因素進行優(yōu)化分析。

2.2 環(huán)境因素對菌株降解效果的影響

2.2.1 處理溫度對氨氮降解效果的影響

溫度是影響微生物生長與代謝的重要環(huán)境因素之一，同時也是影響生物脫氮的重要原因。吸取NX3菌的菌種液，實驗按10%的接種量，分別接種到預(yù)先配置初始氨氮質(zhì)量濃度為100 mg/L的選擇培養(yǎng)基中，然后分別置于溫度為25、30、35、40、45 ℃，120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，48 h后測定培養(yǎng)基中殘余的氨氮濃度，計算相應(yīng)的氨氮降解率，繪制氨氮降解率與反應(yīng)溫度的曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可見在選擇培養(yǎng)基中隨著反應(yīng)溫度的升高，曲線呈現(xiàn)上升趨勢，氨氮降解率有所增加，在30 ℃時達到最大值，但隨著溫度進一步升高，氨氮降解率反而下降?？赡苡捎谖⑸锂a(chǎn)生的酶具有最適溫度，酶的活性在一定溫度范圍內(nèi)是隨溫度升高而增加的，但當溫度超過這個最適溫度后，酶活就會逐漸降低，酶甚至出現(xiàn)失活，相應(yīng)的酶所催化的酶促反應(yīng)速率也將隨之下降。因此NX3菌株適宜溫度為30 ℃。

圖3 處理溫度對氨氮降解效果的影響 Fig.3 Effect of temperature on ammonia nitrogen removal

2.2.2 反應(yīng)pH值對氨氮降解效果的影響

將初始氨氮濃度為100 mg/L的選擇培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。吸取NX3菌的菌種液，實驗按10%的接種量，分別接種至配置好的選擇培養(yǎng)基中，在30 ℃、120 r/min的條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48 h后，測定培養(yǎng)基中殘余的氨氮質(zhì)量濃度，計算相應(yīng)pH值下氨氮的降解率，并繪制出氨氮降解率與pH值的關(guān)系曲線，結(jié)果見圖4。由圖4可見隨著選擇培養(yǎng)基中pH值的逐漸升高，菌株對氨氮的降解率呈現(xiàn)上升趨勢，pH值在7.0時，氨氮降解率達到最大值為35.70%，隨后曲線呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。這可能由于外界環(huán)境中氫離子的濃度超過或低于微生物酶的一定的適應(yīng)范圍，而引起該種微生物原生質(zhì)膜的電荷發(fā)生變化，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及其酶的活性，進而影響酶促反應(yīng)的速率，從而影響微生物的代謝。因此在考慮初始時菌株的生長需要，反應(yīng)的pH值應(yīng)控制在7.0左右為宜。

圖4 反應(yīng)pH值對氨氮降解效果的影響Fig.4 Effect of pH on ammonia nitrogen removal

2.2.3 初始氨氮質(zhì)量濃度對氨氮降解效果的影響

當污水中氨氮濃度過高時，氨氮降解菌及其他細菌的生長會受到抑制甚至停止，從而影響其對氨氮的降解[12]。分別配制氨氮初始含量為50、100、200、300、400 mg/L的選擇培養(yǎng)基，反應(yīng)的pH值調(diào)節(jié)至7.0，將NX3接種至上述培養(yǎng)基中，在30 ℃、120 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，48 h后測定選擇培養(yǎng)基中的殘余氨氮質(zhì)量濃度，計算出相應(yīng)的氨氮降解率，并繪制氨氮降解率與氨氮初始質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線，結(jié)果見圖5。培養(yǎng)基的氨氮質(zhì)量濃度在50～200 mg/L時，曲線呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，說明隨著培養(yǎng)基中初始氨氮質(zhì)量濃度逐漸升高，其菌株對氨氮的降解率也隨之升高；初始氨氮質(zhì)量濃度在300 mg/L時降解率達到最大為45.43%；當初始氨氮的質(zhì)量濃度高于300 mg/L時，曲線呈現(xiàn)下降趨勢，表示隨著初始氨氮質(zhì)量濃度的升高，該菌株對氨氮的降解率呈現(xiàn)出下降趨勢。菌株NX3的不同初始氨氮質(zhì)量濃度影響的實驗結(jié)果表明，當初始氨氮質(zhì)量濃度較高時，其氨氮降解效果較為明顯，說明此時環(huán)境中的營養(yǎng)對NX3菌的生長較為適宜，而初始氨氮質(zhì)量濃度過高時，會對菌株NX3的生長產(chǎn)生一定的抑制作用，導(dǎo)致菌株對氨氮的降解率下降，因此，氨氮降解菌NX3適宜的氨氮初始質(zhì)量濃度為300 mg/L。

圖5 初始氨氮質(zhì)量濃度對氨氮降解效果的影響Fig.5 Effect of ammonia nitrogen beginning concentration on its removal

2.3 NX3菌株的初步鑒定

菌株NX3菌落為中央白，邊緣呈透明，邊緣鋸齒狀；菌體為桿狀菌，有芽孢、無莢膜，無鞭毛，革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陽性；NX3菌株生理生化實驗，結(jié)果見表2，根據(jù)文獻[10-11]初步鑒定，這些特征均符合芽孢桿菌屬(Bacillus)的特征。

表2 NX3的生理生化特性

注：“+” 代表陽性；“-”代表陰性。

3 結(jié) 論

通過對活性污泥中微生物的分離與純化，以硫酸銨為唯一氮源篩選得到1株對氨氮具有較好降解作用的菌株NX3，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)，是一類具有重要的環(huán)境修復(fù)意義的微生物。選擇NX3菌為研究菌種，進一步測定氨氮降解的影響因素?？疾炝颂幚頊囟?、pH值、初始氨氮質(zhì)量濃度對該菌株氨氮降解效果的影響，研究結(jié)果表明當溫度為30 ℃，pH值為7.0，初始氨氮質(zhì)量濃度為300 mg/L時，該菌株對氨氮的降解效果較好，氨氮降解率為45.43%。因此應(yīng)用該微生物降解污水中的氨氮，改善環(huán)境是可行的。

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Isolation, identification and degradation of ammonia nitrogen degradating bacterium

MIAO Miao, WANG Ji-Hua*, YANG Xue-Chen, CHEN Dai-Ci, DU Xue

(Life Science and Technology College, Harbin Normal University, Harbin, 150025, China)

(NH4)2SO4as the sole nitrogen source medium, isolated eight strains with the ability to degrade ammonia from activated sludge screening,a high effective microorganism named NX3 in degrading ammonia-nitrogen was obtained after comparison of degrading rate and growth among the various strains.The strain was initial identified asBacillus, then utilized the biomass to test the optimal conditions of growth.Experimental results show that the ammonia-nitrogen could be degraded 45.53% when the strain was 30℃, with the initial concentration at about 300 mg/L, and pH value was about 7.0.

activated sludge; ammonia degradating bacteria; degradation

10.13524/j.2095-008x.2014.01.013

2013-10-21

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目(12521Z010);哈爾濱師范大學(xué)大學(xué)生實踐創(chuàng)新基金項目(Sj060803)；黑龍江省研究生創(chuàng)新科研資金項目(YJSCX2012-190HLJ)

苗 苗(1990-)，女，黑龍江雙鴨山人，碩士研究生，研究方向：微生物遺傳，E-mail：272728361@qq.com;*通訊作者：王繼華(1972-)，女，黑龍江慶安人，教授，研究方向：微生物遺傳學(xué)、環(huán)境微生物，E-mail：wangjihua333@hotmail.com。

Q93

A

2095-008X(2014)01-0059-05