徐明芳 戴金鳳 向明霞 成希飛 曾曉琮 萬叢慶 周衛(wèi)軍

(暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

近年來，雖然各種質(zhì)譜技術(shù)在硬件和軟件方面都得到不斷完善，但分析和鑒定復(fù)雜體系中的組分還是一大挑戰(zhàn)，對混合蛋白質(zhì)的鑒定和分析也還是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要任務(wù)［1］.二維線性離子阱高分辨靜電場組合質(zhì)譜LTQ Orbitrap XL 組合型傅里葉變換質(zhì)譜是整合了LTQ 線性離子阱質(zhì)譜儀和Orbitrap軌道阱質(zhì)量分析器的組合式質(zhì)譜儀系統(tǒng).在LTQ 靈敏、快速的基礎(chǔ)上增加了軌道阱技術(shù)，具有高分辨率、高質(zhì)量準(zhǔn)確度的特點，只需要納克級的蛋白質(zhì)樣品量，就可用于各種蛋白質(zhì)及多肽鑒定、蛋白質(zhì)肽指紋圖譜及未知蛋白質(zhì)多肽部分測序、蛋白質(zhì)磷酸化位點分析、蛋白質(zhì)活性多肽位點突變分析、二硫鍵分析等研究，具備了從復(fù)雜體系中快速、靈敏、可靠地檢測化合物的能力和持久穩(wěn)定的質(zhì)量精密度、卓越的LC/MSn性能、超強的小分子分析能力等特性，其優(yōu)異的性能使其在常規(guī)化合物的鑒定、復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的分析等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，也廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中.

水牛奶因酪蛋白含量豐富，且能進(jìn)行高質(zhì)量乳制品的深加工，具有無可限量的開發(fā)潛力.為了防止在水牛奶中人為添加廉價蛋白代替牛奶蛋白，導(dǎo)致牛奶蛋白營養(yǎng)價值下降，目前已有多種技術(shù)運用于牛奶乳蛋白的分析，如毛細(xì)管電泳［2］、雙向電泳［3］、反向高效液相色譜［4］、質(zhì)譜［5］及液質(zhì)聯(lián)用［6］等，這些方法對乳蛋白的定量(反向高效液相色譜、毛細(xì)管電泳)、乳蛋白亞基組分分離及鑒定［7］(雙向電泳、液質(zhì)聯(lián)用)等都有報道，但對于乳蛋白肽質(zhì)量指紋圖譜及氨基酸精細(xì)結(jié)構(gòu)的分析，雙向電泳與質(zhì)譜連用技術(shù)則呈現(xiàn)出耗時、雙向電泳膠條及試劑依賴進(jìn)口產(chǎn)品、分析成本高等不足.近年來隨著生物質(zhì)譜分析技術(shù)水平的不斷提高，LTQ Orbitrap MS 對于完整的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定和酶解肽段的結(jié)構(gòu)特征分析［8］具有高效、快速、分析成本低等顯著的優(yōu)越性，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)及其他化學(xué)物質(zhì)的分析［9-12］.

文中應(yīng)用LTQ Orbitrap XL 組合型傅里葉變換高分辨質(zhì)譜聯(lián)合反相高效液相色譜技術(shù)建立了水牛奶酪蛋白各組分和大豆分離蛋白(SPI)主要組分的肽質(zhì)量指紋圖譜，并對其完整的氨基酸序列差異性進(jìn)行了分析，以期為準(zhǔn)確、高效鑒定牛奶中是否添加廉價蛋白提供可靠的方法，為復(fù)雜體系中鑒定分析微量物質(zhì)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水牛奶，購于當(dāng)?shù)亓闶凵?大豆分離蛋白［13］，華南理工大學(xué)植物蛋白深加工實驗室提供;乙腈、碳酸氫銨、三氟乙酸(TFA)、DL-二硫蘇糖醇(DTT)、吲哚-3-乙酸(IAA)，美國Sigma 公司產(chǎn)品;胰蛋白酶，美國Promega 公司產(chǎn)品;LTQ Orbitrap XL 質(zhì)譜儀，Thermo 公司生產(chǎn);C18 反相色譜柱，Michrom Bioresources 公司生產(chǎn);SCIENTZ-11D 型超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物儀器公司生產(chǎn).

1.2 溶液配制

用雙重去離子水配制以下實驗用溶液:100mmol/L NH4HCO3(790.6 mg NH4HCO3溶于去離子水中，定容到100 mL);脫色液(2.5 mL 100%乙腈，1.25 mL 100 mmol/L NH4HCO3，1.25 mL ddH2O);還原劑(12.4 mg DTT，2 mL 100 mmol/L NH4HCO3，6 mL ddH2O);烷基化試劑(40.69mg IAA，1mL 100mmol/L NH4HCO3，3 mL ddH2O);覆蓋液(1 mL100 mmol/L NH4HCO3，0.4 mL 100%乙腈，2.6 mL ddH2O);酶液儲液(2 μg 胰蛋白酶加入到150 μL 預(yù)冷的覆蓋液中)，-80 ℃下保存;胰蛋白酶工作液，用覆蓋液將酶液儲液稀釋至胰蛋白酶含量為0.02 g/L;萃取液(0.075 mL TFA，2.01 mL 100% 乙腈，0.915 mL ddH2O);蛋白樣品溶解液(0.001 mL 甲酸，0.02 mL 100%乙腈，0.979 mL ddH2O;25 mmol/L NH4HCO3(含10 mmol/L DTT )混合溶液(19.77 mg NH4HCO3，15.43 mg DTT，10 mL ddH2O).

1.3 實驗方法

1.3.1 SDS-PAGE 凝膠電泳

取60 mL 新鮮水牛奶，4 ℃條件下4000 r/min 離心20 min，脫脂，調(diào)pH 值至4.6，4 000 r/min 離心15 min，取沉淀用蒸餾水、丙酮依次洗滌兩次，每次4000 r/min離心10 min.收集沉淀風(fēng)干.將沉淀酪蛋白與大豆分離蛋白用樣品溶解液分別配制成2 g/L的蛋白樣品溶液，備用.SDS-PAGE 電泳，兩種蛋白樣品上樣量均為10 μL，濃縮膠4%，濃縮電壓60 V;分離膠12%，分離電壓100 V.

1.3.2 酶解

刀片切下膠點，用去離子水洗膠兩次，每次振蕩1 min，靜置5～10 min 后去掉液體，加入50%乙腈溶液，37 ℃水浴脫色至透明為止，再用100%乙腈脫水至膠塊變成白色，加入還原劑，用25 mmol/L 的NH4HCO3(含10 mmol/L DTT)封口，57 ℃水浴1 h，然后室溫冷卻，去掉液體，迅速加入同體積的烷基化試劑，室溫暗處放置30min 后去掉烷基化試劑，加入50%乙腈溶液，放置15 min 后，加入50 mmol/L 的NH4HCO3震蕩后靜置吸脹5 min，再加50%乙腈脫水一遍，100%乙腈脫水至膠塊變成白色，加入約2～3 μL 酶液(采用常規(guī)胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶液質(zhì)量濃度為0.01 g/L )冰上放置30 min，直至膠塊吸脹酶液，加覆蓋液20 μL 封口，37 ℃保溫16～18 h.取出樣品，在10 000 g/min 條件下超速離心5 min，取上清液加入到EP 管中，剩余膠塊加入萃取液中37 ℃保溫30 min，超聲，取上清液加入之前的EP 管中，凍干.

1.3.3 質(zhì)譜分析

凍干的酶解片段用樣品溶解液溶解，充分振蕩渦旋，13200 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液進(jìn)行質(zhì)譜分析.樣品經(jīng)C18 反相柱(100 mm ×100 μm i.d，3 μm)分離后，用于LTQ Orbitrap XL 檢測.樣品在反相柱上洗脫梯度5%～45%乙腈(含0.1%甲酸)，洗脫60 min，流速300 nL/min.

質(zhì)譜參數(shù):離子傳輸管溫度200 ℃;電噴霧電壓為1.85 kV.一級質(zhì)譜Orbitrap 掃描范圍是400～2000 u，從一級質(zhì)譜里選取信號較強的母離子做二級質(zhì)譜，動態(tài)排除功能開啟，時間90 s.二級質(zhì)譜LTQ 為CID 碰撞模式，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量為35%，活化q 值0.25，活化時間30 ms.肽段信息通過Mascot搜尋軟件上網(wǎng)(http:∥www.matrixscience.com)進(jìn)行蛋白質(zhì)庫搜尋鑒定得出結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

經(jīng)過胰蛋白酶水解的水牛奶酪蛋白和大豆蛋白的多肽混合物經(jīng)LTQ Orbitrap XL 組合型傅里葉變換高分辨質(zhì)譜分析，根據(jù)Mascot 得分、匹配的肽段片段數(shù)和覆蓋率等綜合評判，可以分別鑒定出水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要組分的信息.以αs酪蛋白(αs-CN)為例，水牛奶αs-CN 的總離子流指紋圖譜(一級質(zhì)譜圖)如圖1 所示.選出的母離子經(jīng)過二級質(zhì)譜鑒定肽段的氨基酸序列，其二級質(zhì)譜圖及其匹配的氨基酸序列如圖2 所示，根據(jù)這些肽段信息檢索數(shù)據(jù)庫，可以鑒定圖2 所有的肽段均屬于αs1酪蛋白.

圖1 水牛奶αs-CN 酪蛋白的總離子流指紋圖譜Fig.1 Total ionic chromatographic fingerprints of αs-CN of water buffalo milk casein

圖2 水牛奶αs-CN 肽段組分二級質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS spectra of αs-CN peptide fragmentation of water buffalo milk casein

2.1 水牛奶酪蛋白氨基酸序列信息

水牛奶酪蛋白由一類結(jié)構(gòu)和性質(zhì)較近似的蛋白組成，主要包括αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白，其含量分別占全酪蛋白的48%、34%、12%左右，其中αs-酪蛋白又分為αs1-CN 和αs2-CN，αs1-CN、αs2-CN分別占αs-CN 的38%和10%左右.南方水牛奶酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解得到的片段經(jīng)LTQ Orbitrap XL MS 分析，可鑒定出全部的肽段.得到的肽段經(jīng)分析可鑒定出肽段的來源，如HQGLPQGVLNENLLR、HKEMPFPK、IAKYIPIQYVLSR 分別屬于αs1-CN、β-CN和κ-CN 的酶解肽段.水牛奶酪蛋白αs1-CN、β-CN和κ-CN 經(jīng)酶解得到的全部肽段信息通過Mascot 軟件搜索可以獲得水牛乳酪蛋白氨基酸組成的全序列(見表1)，但結(jié)果中沒有搜索到與水牛奶αs2-CN 相匹配的氨基酸肽段序列.

2.2 大豆蛋白氨基酸序列信息

大豆中含有30%～50%的大豆蛋白，經(jīng)過提純得到大豆分離蛋白，大豆分離蛋白是一種價格低廉的全價蛋白，蛋白質(zhì)含量不少于90%，主要由功能和營養(yǎng)特性各異的球蛋白2S、7S、11S 和15S 組成，其中7S 和11S 占大豆球蛋白的70%以上，7S 組分主要為大豆伴球蛋白(Conglycinin)，11S 組分則為大豆球蛋白(Glycinin).從聚集態(tài)結(jié)構(gòu)分析，7S 含有3 種不同的亞基，為三聚體;而11S 含有5 種不同的亞基，為六聚體［14-17］.經(jīng)過質(zhì)譜鑒定分析，分別獲得11S 的5 個亞基和7S 的3 個亞基蛋白的氨基酸肽段序列及不同亞基的氨基酸全序列，如表2、表3所示.

水牛奶酪蛋白和大豆蛋白在蛋白組分、分子質(zhì)量及亞基組分的氨基酸序列等方面均呈現(xiàn)出明顯的差異，如表4 所示.

表4 結(jié)果顯示，大豆蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解得到的肽段數(shù)量(181 個)遠(yuǎn)超出酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解得到的肽段數(shù)量(28 個)，最多的為β 伴大豆球蛋白α 鏈亞基，經(jīng)酶解可檢測出30 個肽段，而αs酪蛋白最多檢出12 個肽段，尤其重要的是，在大豆蛋白酶解得到的所有肽段中不能找到與酪蛋白經(jīng)酶解得到的肽段相匹配的肽段.此外，大豆蛋白的各組分亞基的氨基酸全序列均大于酪蛋白各組分的氨基酸全序列，且大豆蛋白各組分的分子質(zhì)量均顯著高于酪蛋白各組分，氨基酸序列最長的為β 伴大豆球蛋白α鏈，氨基酸數(shù)量為617，分子質(zhì)量為74565 u.

表1 水牛奶酪蛋白全氨基酸序列1)Table 1 Amino acid sequences of water buffalo milk casein

表2 大豆球蛋白氨基酸序列Table 2 Amino acid sequences of soybean glycinin

續(xù)表

表3 大豆β 伴球蛋白氨基酸序列Table 3 Amino acid sequences of soybean β-conglycinin

表4 水牛奶酪蛋白和大豆蛋白差異性Table 4 Differences of water buffalo milk casein and soybean protein

2.3 水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要組分氨基酸的對比

不同蛋白的營養(yǎng)價值不同，蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值常用生物價(BV)來衡量，生物價越高說明蛋白被有機體的利用率越高，營養(yǎng)價值也就越高，而蛋白的營養(yǎng)價值與氨基酸的數(shù)量、排列方式和組成比例都有關(guān)系，牛奶的生物價約為85，大豆的生物價約為64.根據(jù)質(zhì)譜鑒定獲得的結(jié)果，對水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要組分氨基酸全序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，酪蛋白和大豆蛋白都含有豐富的氨基酸，但氨基酸數(shù)量、組成比例和排列方式都有明顯的差異.就其數(shù)量而言，酪蛋白的前體信號肽氨基酸的數(shù)量及酪蛋白主鏈的氨基酸數(shù)量與大豆蛋白都不相同，且大豆蛋白的氨基酸主鏈的氨基酸數(shù)量均多于水牛奶酪蛋白的氨基酸數(shù)量.就氨基酸組成比例而言，20 種氨基酸中，除苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸外，各種必需氨基酸占其全序列比例最大的都屬于酪蛋白，除丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和脯氨酸外，各種非必須氨基酸占其全序列比例最大的都屬于大豆蛋白，其中，酪蛋白中各組分脯氨酸所占氨基酸序列的比例均大于大豆蛋白，精氨酸和天冬酰胺所占氨基酸序列的比例均小于大豆蛋白.在8 種必需氨基酸中，蘇氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸所占比例最高的均屬于酪蛋白分子;苯丙氨酸、色氨酸、賴氨酸所占比例最高的屬于大豆蛋白.在12 種非必需氨基酸中，丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸比例最高的屬于酪蛋白分子，其他8 種氨基酸比例最高的屬于大豆蛋白，如表5 所示，這從乳源蛋白肽質(zhì)指紋結(jié)構(gòu)中證實了乳源蛋白的生物效價高于植物大豆蛋白.就氨基酸排列而言，酪蛋白和大豆蛋白氨基酸的排列方式差異很明顯，而大豆蛋白的同種蛋白亞基間雖氨基酸的數(shù)量有差異，但排列方式卻有許多相同的地方.酪蛋白中蛋白分子αs1-CN，β-CN 不含半胱氨酸，大豆β 伴球蛋白的β 鏈不含甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸，這為今后蛋白組分的差異鑒定提供了依據(jù).

表5 酪蛋白和大豆蛋白主要蛋白組分氨基酸比例Table 5 Proportion of amino acids of main protein of water buffalo milk casein and soybean protein %

續(xù)表

3 結(jié)語

通過LTQ Orbitrap XL 對酪蛋白和大豆蛋白的各個組分進(jìn)行分析，獲得水牛奶酪蛋白主要組分(αs1-CN、β-CN、κ-CN)和大豆蛋白主要組分(包括大豆球蛋白G1、G2、G3、G4、G5 和大豆伴球蛋白α、α'、β 鏈)共11 種蛋白組分的肽段的氨基酸序列信息，及各組分的完整氨基酸序列.通過比較發(fā)現(xiàn)，水牛奶酪蛋白氨基酸序列經(jīng)胰蛋白酶酶解獲得的肽段數(shù)量及蛋白各組分氨基酸全序列，在氨基酸數(shù)量、排列方式和組成比例等方面都與大豆蛋白有明顯的差異.此方法為今后快速準(zhǔn)確地鑒定水牛奶中廉價的大豆蛋白以及從復(fù)雜體系中檢測微量物質(zhì)提供了可靠的依據(jù).

［1］Erve John C L，Gu M，Wang Y D，et al.Spectral accuracy of molecular ions in an LTQ/Orbitrap mass spectrometer and implications for elemental composition determination［J］.Am Soc Mass Spectrom，2009，20:2058-2069.

［2］王麗娜，李子超，李昀鍇，等.基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳系統(tǒng)的南方水牛奶酪蛋白分析技術(shù)研究［J］.分析測試學(xué)報，2011，30(3):264-268.Wang Li-na，Li Zi-chao，Li Yun-kai，et al.Analysis of waterbuffalo caseins in South China by capillary zone electrophoresis［J］.Journal of Instrumental Analysis，2011，30(3):264-268.

［3］Kuhla S，Rudolph P E，Albrecht D，et al.A milk diet partly containing soy protein does not change growth but regulates jejunal proteins in young goats［J］.Journal of Dairy Science，2007，90:4334-4345.

［4］Bonfatti Valentina，Grigoletto Luca，Cecchinato Alessio，et al.Validation of a new reversed-phase high-performance liquid chromatography method for separation and quantification of bovine milk protein genetic variants ［J］.Journal of Chromatography A，2008，1195:101-106.

［5］Aline Soriano L，Jerusa Simone G，Rodrigo Ramos C，et al.Cloud point extraction applied to casein proteins of cow milk and their identification by mass spectrometry［J］.Analytica Chimica Acta，2007，590:166-172.

［6］Czerwenka Christoph，Muller Luká?，Lindner Wolfgang.Detection of the adulteration of water buffalo milk and mozzarella with cow's milk by liquid chromatography-mass spectrometry analysis β-lactoglobulin variants［J］.Food Chemistry，2010，122:901-908.

［7］向明霞，王麗娜，徐明芳.基于雙向電泳和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的水牛乳源酪蛋白的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(12):188-190，200.Xiang Ming-xia，Wang Li-na，Xu Ming-fang.Analysis of water buffalo milk in South China by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry combined technology［J］.Science and Technology of Food Industry，2012，33(12):188-190，200.

［8］Ansari Parisa，Stoppacher Norbert，Rudolf Judith，et al.Selection of possible marker peptides for the detect ion of major ruminant milk proteins in food by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Anal Bioanal Chem，2010，399(3):1105-1115.

［9］Dunn W B，Broadhurst D，Brown M，et al.Metabolic profiling of serum using ultra performance liquid chromatography and the LTQ-Orbitrap mass spectrometry system［J］.Journal of Chromatography B，2008，871:288-298.

［10］Peng J B，Jia H M，Liu Y T，et al.Qualitative and quantitative characterization of chemical constituents in Xin-Ke-Shu preparations by liquid chromatography coupled with a LTQ Orbitrap mass spectrometer［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，55:984-995.

［11］徐明芳，戴金鳳，向明霞，等.基于LTQ-Orbitrap 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的乳源乳清蛋白組分的差異性研究［J］.分析化學(xué)，2014，42(4):501-506.Xu Ming-fang，Dai Jin-feng，Xiang Ming-xia，et al.Study on differences of milk proteins by Linear Trap Quadropole-Orbitrap LC-MS/MS［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2014，42(4):501-506.

［12］Théberge R，Infusini G，Tong W W，et al.Top-down analysis of small plasma proteins using an LTQ-Orbitrap.Potential for mass spectrometry-based clinical assays for transthyretin and hemoglobin ［J］.International Journal of Mass Spectrometry，2011，300:130-142.

［13］楊國龍，趙謀明，楊曉泉，等，選擇性酶解-超濾制備大豆改性蛋白［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2005，33(10):78-83.Yang Guo-long，Zhao Mou-ming，Yang Xiao-quan，et al.Preparation of modified soy protein by selective Enzymolysis-Ultrafiltration［J］.Journal of South China University of Technology:Natural Science Edition，2005，33(10):78-83.

［14］趙謀明，張遠(yuǎn)紅，崔春，等，胃蛋白酶前處理對大豆蛋白酶解特性的影響［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2012，40(8):110-115.Zhao Mou-ming，Zhang Yuan-hong，Cui Chun，et al.Effect of pepsin pretreatment on hydrolysis characteristics of soy protein ［J］.Journal of South China University of Technology:Natural Science Edition，2012，40(8):110-115.

［15］朱曉燁，遲玉杰，劉紅玉.大豆蛋白7S 和11S 組分分離方法的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(7):267-273.Zhu Xiao-ye，Chi Yu-jie，Liu Hong-yu.Optimization of separation method of 7S and 11S in soy protein［J］.Science and Technology of Industry，2011，32(7):267-273.

［16］于泓鵬，唐傳核，曾慶孝，等.大豆分離蛋白水解多肽聚集物的組成及相互作用［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2006，34(8):105-109.Yu Hong-peng，Tang Chuan-he，Zeng Qing-xiao，et al.Composition and interaction of aggregate of peptides derived from soy protein lsolates［J］.Journal of South China University of Technology:Natural Science Edition，2006，34(8):105-109

［17］管娟，田琨，姚晉榮，等.高分子量大豆蛋白的溶液制備及組份分離［J］.高分子學(xué)報，2010(2):250-254.Guan Juan，Tian Kun，Yao Jin-rong，et al.Preparation of high molecular weight soy protein aqueous solution and separation of its main components［J］.Acta Polymerica Sinica，2010(2):250-254.