曹恬雪，蔣文燦,2*，何文成，紀(jì)鳳仙，魏志剛

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014；2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014)

沙門氏菌(Salmonella)感染可以引起人和動(dòng)物的傷寒、副傷寒、胃腸炎和敗血癥等疾病，還可以造成懷孕母畜發(fā)生流產(chǎn)。不但導(dǎo)致畜禽死亡，還會(huì)因生長(zhǎng)遲緩、產(chǎn)量下降等造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。沙門氏菌也是人類食物中毒的主要病原之一，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

研究表明沙門氏菌的致病性是由大量的毒力因子相互作用所致。本文對(duì)國(guó)內(nèi)外在沙門氏菌的結(jié)構(gòu)性毒力因子、腸毒素、毒力質(zhì)粒、毒力島及Ⅲ型分泌系統(tǒng)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為開(kāi)展相關(guān)研究提供參考。

1 結(jié)構(gòu)性毒力因子

1.1 菌毛菌毛是細(xì)菌表面的纖細(xì)結(jié)構(gòu)，與細(xì)菌黏附上皮細(xì)胞及在小腸粘膜的定植有關(guān)。根據(jù)菌毛形態(tài)和凝集紅細(xì)胞的能力，沙門氏菌菌毛主要分為4類。Ⅰ型和Ⅱ型菌毛形態(tài)相似，Ⅰ型菌毛廣泛分布于沙門氏菌屬內(nèi)，Ⅱ型菌毛僅在雞白痢、都柏林、乙型副傷寒等沙門氏菌中被發(fā)現(xiàn)。Ⅰ型菌毛可以介導(dǎo)甘露糖敏感血凝反應(yīng)，而Ⅱ型菌毛缺乏凝集紅細(xì)胞的能力。Ⅲ型和Ⅳ型菌毛形態(tài)相似，較細(xì)而且容易彎曲，在甘露糖存在時(shí)仍可凝集鞣酸處理的紅細(xì)胞。Ⅲ型菌毛只在腸炎、鼠傷寒等沙門氏菌中表達(dá)，Ⅳ型菌毛的報(bào)道較少。沙門氏菌還有兩種體積差異較大而且缺乏凝集紅細(xì)胞能力的菌毛，按其主要亞單位蛋白大小命名為 SEF14 和 SEF17[1]。

菌毛有助于菌體黏附到動(dòng)物細(xì)胞并促進(jìn)其定植，同時(shí)帶菌毛菌株的致病力和活力均強(qiáng)于先天無(wú)菌毛菌株或菌毛缺失的菌株。沙門氏菌菌毛作為抗原被廣泛應(yīng)用于免疫和病原的檢測(cè)方面。研究表明腸炎沙門氏菌Ⅰ型和Ⅲ型菌毛抗原免疫小鼠存活率提高60%，從而預(yù)測(cè)腸炎沙門氏菌SEF14、SEF17和SEF21等多種菌毛的聯(lián)合免疫可以產(chǎn)生更好的保護(hù)效果[2]。根據(jù)SEF14柔毛抗原的特性，Rajashekara等建立了一種簡(jiǎn)便的乳膠凝集試驗(yàn)成功區(qū)別檢測(cè)腸炎沙門氏菌的感染[3]。近年，國(guó)內(nèi)研究者利用鼠傷寒沙門氏菌SEF14菌毛基因agfA作為禽流感疫苗載體，構(gòu)建能夠引起機(jī)體細(xì)胞免疫的活體重組疫苗，對(duì)禽流感的預(yù)防具有重要意義[4]。

1.2 外膜蛋白外膜蛋白(Outer membrane protein)是革蘭氏陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)成分。按其在細(xì)胞中的拷貝數(shù)高低，沙門氏菌的外膜蛋白可分為外膜A蛋白(OmpA)、微孔蛋白、脂蛋白和微量蛋白。OmpA屬于跨膜蛋白，對(duì)外膜結(jié)構(gòu)的維持起著重要作用。缺乏OmpA的突變株細(xì)菌的外膜蛋白不穩(wěn)定，不能轉(zhuǎn)運(yùn)肽類，氨基酸總轉(zhuǎn)運(yùn)率下降，并且失去F因子介導(dǎo)的細(xì)胞接合功能。當(dāng)OmpA溶于高于50℃的SDS溶液中，其分子量增加，因此OmpA又稱熱修飾蛋白。微孔蛋白也稱為基質(zhì)蛋白，是一類具有滲透特性的主要外膜蛋白。它以非共價(jià)鍵與肽聚糖緊密結(jié)合而形成相對(duì)非特異性的通道，因此具有通透特性。脂蛋白則為細(xì)胞外膜中含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，但并不是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的，有利于維持外膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。微量蛋白在細(xì)胞內(nèi)含量低，卻具有相當(dāng)重要的功能；許多微量蛋白(如TonA、FepA等)與細(xì)胞生長(zhǎng)密不可分。

傷寒沙門菌的OmpD參與巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的識(shí)別；微孔蛋白能觸發(fā)多重協(xié)同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘發(fā)細(xì)胞激活及細(xì)胞因子釋放，增強(qiáng)蛋白酪氨酸激酶、蛋白激酶A及蛋白激酶C等[5-6]。傷寒菌的ompS1、ompS2基因編碼與OmpC、OmpF蛋白相關(guān)的兩個(gè)低水平表達(dá)的外膜蛋白，利用該基因的突變菌株感染小鼠，其毒力比野生株明顯降低[7]。傷寒菌外膜蛋白及鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白能刺激宿主產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)[8]，具有良好的免疫保護(hù)性，因而可用于高效價(jià)抗體和疫苗的研制。利用反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎患者的血清及關(guān)節(jié)液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，表明傷寒菌的外膜蛋白是觸發(fā)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎的細(xì)菌組分[9]。研究表明鼠傷寒沙門氏菌的OmpA能夠刺激樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤免疫，為抗腫瘤的免疫治療提供了新途徑[10]。

1.3 脂多糖脂多糖(Lipopolysaccharides)位于革蘭氏陰性菌外膜的最表面，在細(xì)菌崩裂時(shí)釋出，是很強(qiáng)的發(fā)熱原。沙門氏菌的脂多糖主要由類脂A、核心多糖和側(cè)鏈多糖組成，在防止宿主吞噬細(xì)胞的吞噬和殺傷作用中起重要作用。類脂A是構(gòu)成內(nèi)毒素的主要部分，吞噬細(xì)胞相應(yīng)受體識(shí)別類脂A的特定結(jié)構(gòu)而引起相應(yīng)的炎癥反應(yīng)。在對(duì)鼠傷寒沙門氏菌脂多糖的研究中顯示，脫酰酶LpxR過(guò)量表達(dá)時(shí)引起類脂A的3'-O-脫酰作用脫掉兩條?；?，類脂A的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而不能被吞噬細(xì)胞相應(yīng)受體識(shí)別，從而有利于細(xì)菌在吞噬細(xì)胞中增殖；另一種脫酰酶PagL隱藏于細(xì)菌外膜上，某些點(diǎn)突變可使PagL從隱藏區(qū)域釋放出來(lái)，沉淀分析顯示隱藏的PagL與脂多糖相關(guān)，而釋放出的PagL突變體卻與膜蛋白相關(guān)，這種突變會(huì)影響PagL與脂多糖之間的相互作用[11]。

側(cè)鏈多糖在LPS的最外側(cè)，即O抗原。Kumirska等利用核磁共振波譜法及質(zhì)譜分析法，首次從沙門氏菌血清群O∶28的101種血清型中確定一種特殊的O抗原單位結(jié)構(gòu)，這在沙門氏菌血清分型中具有重大意義[12]?？怪嗵菃慰寺】贵w對(duì)雞白痢沙門氏菌和其他血清群沙門氏菌都具有特異性，可以用于沙門氏菌檢測(cè)方法研究[13]。用缺失LPS和恢復(fù)LPS的沙門氏菌SstpNPG分別感染小牛，在所有小牛的血液及腦組織中都能檢測(cè)到SstpNPG，但只有LPS恢復(fù)株引起實(shí)驗(yàn)小牛的神經(jīng)癥狀。該研究首次證明牛的非傷寒沙門氏菌腦病的臨床癥狀與脂多糖有關(guān)[14]。

1.4 莢膜早期對(duì)傷寒沙門菌的研究表明有莢膜菌株比莢膜缺失菌株引起發(fā)病率高，莢膜是沙門氏菌重要的毒力因子。莢膜也具有一定的抗原性又稱為Vi抗原。莢膜能夠阻斷O抗原與其相應(yīng)抗體的反應(yīng)，對(duì)細(xì)菌本身具有保護(hù)作用。傷寒沙門菌的莢膜對(duì)其存活于宿主體內(nèi)及逃避機(jī)體的防御機(jī)理具有重要作用。近年，莢膜多糖免疫法開(kāi)始用于預(yù)防傷寒沙門氏菌病。莢膜多糖的產(chǎn)生依賴于細(xì)菌的生長(zhǎng)，通過(guò)補(bǔ)料分批培養(yǎng)優(yōu)化傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的莢膜多糖，結(jié)果表明莢膜多糖的合成與營(yíng)養(yǎng)成分及發(fā)酵條件密切相關(guān)，在細(xì)菌生長(zhǎng)初期和穩(wěn)定期，高濃度的葡萄糖會(huì)抑制莢膜多糖的合成[15]。根據(jù)Vi分子帶負(fù)電荷、Vi在不同溶劑中的選擇性溶解度以及橫向氣流微濾等條件最大化地除去雜質(zhì)，使得最終獲得高純度的莢膜多糖，該方法可用于規(guī)?；a(chǎn)，其產(chǎn)量高且成本低，為制備莢膜多糖疫苗提供了有效途徑[16]。

莢膜多糖的保護(hù)性取決于O-乙酰基團(tuán)的存在，利用Vi抗血清作為酶免疫分析法(EIA)的陽(yáng)性抗體，進(jìn)行傷寒沙門菌莢膜多糖的O-乙?；鶊F(tuán)的檢測(cè)，并用核磁共振法對(duì)比其靈敏度，表明EIA能夠鑒別O-乙?；c非O-乙酰化的莢膜多糖樣品，但對(duì)于O-乙酰化水平低于25%的樣品，該方法靈敏度低；Vi抗血清可用來(lái)檢測(cè)莢膜多糖亞單位疫苗中菌莢膜多糖的O-乙酰化水平，以評(píng)價(jià)其免疫原性，有利于對(duì)莢膜多糖疫苗的質(zhì)量控制[17]。將傷寒沙門氏菌莢膜多糖與白喉類毒素結(jié)合后接種小鼠并檢測(cè)其抗體水平，結(jié)果表明莢膜多糖結(jié)合白喉類毒素的量越多其免疫保護(hù)性就越強(qiáng)，利用該結(jié)合物(Vi-DT)免疫接種能夠克服單獨(dú)使用莢膜多糖引發(fā)的免疫抑制，從而建立了Vi-DT的理化特性與免疫應(yīng)答反應(yīng)之間的相關(guān)性[18]。

2 腸毒素

外毒素是病原菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的對(duì)宿主細(xì)胞有毒性的可溶性蛋白質(zhì)。外毒素有極強(qiáng)的毒性作用，也具有良好的免疫原性。在0.4%甲醛溶液作用下外毒素可脫毒為類毒素，但仍保留其原有的抗原性，可作為疫苗進(jìn)行免疫接種。沙門氏菌腸毒素與宿主腹瀉等癥狀有關(guān)，有研究顯示其作用機(jī)制與霍亂毒素、大腸桿菌腸毒素相似。早期研究中在鼠傷寒沙門菌中發(fā)現(xiàn)一種熱敏的、細(xì)胞結(jié)合型的霍亂毒素(CT)樣腸毒素，可引起CHO細(xì)胞伸長(zhǎng)；在兔結(jié)扎腸中誘導(dǎo)液體分泌，與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，可提高兔腸細(xì)胞內(nèi)cAMP和前列腺素E2水平；其生物學(xué)活性可被抗CT抗體所中和。利用γ射線處理沙門氏菌腸毒素，獲得的類毒素沒(méi)有毒性但保持原有的免疫原性，從而制備類毒素疫苗，口服和腹腔注射實(shí)驗(yàn)小鳥(niǎo)保護(hù)率平均達(dá)到95%以上。表明γ射線脫毒方法具有安全便捷的特點(diǎn)，同時(shí)可避免動(dòng)物機(jī)體對(duì)傳統(tǒng)甲醛疫苗產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)[19]。

研究表明腸毒素(stn)基因是鼠傷寒沙門菌感染機(jī)制中重要的毒力因子之一，其編碼產(chǎn)物能誘發(fā)小鼠腸腔液體分泌反應(yīng)[20]。此外，Akinyemi等為檢測(cè)水源中沙門氏菌的多重耐藥性和腸毒素基因的情況，從當(dāng)?shù)仉S機(jī)采集200個(gè)樣品分離沙門氏菌并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和stn基因檢測(cè)，結(jié)果37個(gè)樣含有沙門氏菌，這些菌分屬于7個(gè)血清型；其中60%含有stn基因，而且攜帶有stn基因的菌群表現(xiàn)出對(duì)多種抗生素的抵抗力。因此，腸毒素基因?qū)?xì)菌的耐藥性有一定水平的提高[21]。

3 毒力相關(guān)基因

沙門氏菌毒力基因存在其染色體和質(zhì)粒中。在沙門菌染色體中編碼毒力相關(guān)基因的特定區(qū)域被稱為毒力島(SPI)，含有許多與毒力有關(guān)的基因，還編碼與細(xì)菌侵襲力直接相關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)。除染色體中毒力島編碼的毒力基因外，還有小部分毒力基因位于質(zhì)粒中。

3.1 毒力島及Ⅲ型分泌系統(tǒng)

3.1.1 毒力島 沙門氏菌的SPI1、SPI2、SPI3、SPI4和SPI5已研究比較清楚。SPI1位于沙門菌染色體上、下游分別為fhlA和mutS的63'位點(diǎn)處，至少含29個(gè)基因與Ⅲ型分泌系統(tǒng)各組分的編碼相關(guān)；SPI1編碼的蛋白可以侵入宿主細(xì)胞并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，在沙門氏菌侵襲巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。SPI2含40個(gè)基因，組成4個(gè)操縱子，ssa編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)成分，ssr編碼分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)子，ssc編碼分子伴侶，sse編碼分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白；SPI2控制沙門氏菌在吞噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，并使沙門氏菌逃避巨噬細(xì)胞輔酶依賴的殺傷作用。SPI3含 10個(gè) ORFs，組成 6個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，其中mgtCB的產(chǎn)物可介導(dǎo)細(xì)菌在巨噬細(xì)胞和低Mg2+環(huán)境中存活。研究表明攜帶SPI1+SPI2與沙門氏菌的致病性呈正相關(guān)，而且SPI3可作為檢測(cè)沙門氏菌的毒力標(biāo)志[22]。SPI4含18個(gè)ORFs，編碼介導(dǎo)毒素分泌的Ⅰ型分泌系統(tǒng)，并參與調(diào)節(jié)細(xì)菌對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)[23]。SPI5位于都柏林沙門氏菌染色體25'處，上、下游分別為serT和copS/copR，含sop、sip、pip等基因，編碼產(chǎn)物與腸黏膜液體分泌和炎癥反應(yīng)相關(guān)，并且由SPI1和SPI2編碼的蛋白所調(diào)控[24]。

近期陸續(xù)報(bào)道了在傷寒、鼠傷寒、丙型副傷寒等沙門氏菌中新鑒定出SPI6、SPI7、SPI8、SPI9、SPI10、SPI11、SPI12等。SPI6通過(guò)引導(dǎo)伴侶蛋白調(diào)節(jié)菌毛操縱子；SPI7在丙型副傷寒沙門氏菌中被鑒定出，具有血清特異性，編碼sopE噬菌體、Vi抗原基因和ⅣB操縱子[25]；SPI8與pheVtRNA基因相連，編碼2種細(xì)菌素的偽基因及整合酶基因；SPI9編碼Ⅰ型分泌系統(tǒng)和獨(dú)立的Rtx2樣蛋白，與SPI4相似；SPI10包含sefB、sefC和sefR基因，編碼sefA-R和噬菌體以及引導(dǎo)伴侶蛋白調(diào)控菌毛操縱子[26]。

3.1.2 Ⅲ型分泌系統(tǒng) 沙門氏菌的T3SS分別由SPI1和SPI2的基因編碼產(chǎn)物組成，包括外膜蛋白、內(nèi)膜蛋白、附屬蛋白及一些特異性靶蛋白。T3SS有兩大功能：一是指導(dǎo)細(xì)菌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞，并激活相關(guān)的信號(hào)通道，使宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡；二是促使與宿主細(xì)胞接觸的侵襲小體在細(xì)菌表面的裝配。T3SS可分泌幾種效應(yīng)蛋白刺激宿主細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起一系列細(xì)胞反應(yīng)[27]。該分泌和轉(zhuǎn)移過(guò)程是由非常復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄機(jī)制和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)控的。轉(zhuǎn)錄機(jī)制的調(diào)控主要受時(shí)間和空間的限制，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制在與宿主細(xì)胞相互接觸后發(fā)揮其功能，侵入基因表達(dá)的調(diào)控由轉(zhuǎn)錄水平的環(huán)境因素決定。目前，在分子水平僅發(fā)現(xiàn)DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)影響蛋白的分泌；在蛋白水平，AraC家族的InvF和OmpR/ToxR家族的HilA參與沙門氏菌的侵入，HilA又調(diào)節(jié)OrgA、SipC和InvF，它們形成一個(gè)調(diào)控莖環(huán)結(jié)構(gòu)[28]。此外，T3SS還受到調(diào)控網(wǎng)的影響，如菌毛調(diào)控系統(tǒng)、PhoP/PhoQ調(diào)控系統(tǒng)[29]和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白等。

3.2 毒力質(zhì)粒 早期研究表明，在能引起嚴(yán)重全身性感染的沙門菌中普遍存在一大小約50 kb～90 kb的質(zhì)粒，與沙門菌的毒力密不可分，將其稱為沙門氏菌毒力質(zhì)粒(Salmonellaplasmid virulence，spv)。毒力質(zhì)粒含有一段高度保守的約8 kb的核酸片段，即spv基因。該基因由6個(gè)ORFs構(gòu)成：正性調(diào)控基因spvR、4個(gè)效應(yīng)基因spvA、spvB、spvC、spvD以及位于這5個(gè)基因之后的orfE。目前已知spvR編碼LysR/MetR家族轉(zhuǎn)錄活化因子的細(xì)菌調(diào)節(jié)性蛋白，并且使基因按照合成SpvABCD的方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[25]。劉華偉等針對(duì)spvR基因設(shè)計(jì)PCR引物，用于檢測(cè)細(xì)菌樣品，可快速特異性檢測(cè)出具毒力質(zhì)粒的沙門氏菌[30]。spvB編碼一個(gè)65 ku的單鏈多肽，spvA、spvC、spvD分別編碼大小為28.2 ku、28 ku及24.8 ku的蛋白。研究表明，spv基因有利于沙門氏菌在腸外組織細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)，其產(chǎn)物與細(xì)菌的粘附、定植及血清抗性等毒力表型密切相關(guān)。研究還表明，spv基因是細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和生長(zhǎng)繁殖所必需的，毒力表現(xiàn)為細(xì)胞毒性，細(xì)菌增殖可致巨噬細(xì)胞凋亡[31]。

4 小 結(jié)

沙門氏菌的菌毛、外膜蛋白、脂多糖、莢膜等均屬于重要的菌體結(jié)構(gòu)成分，目前，沙門氏菌結(jié)構(gòu)性毒力因子的生物學(xué)特性及致病機(jī)制方面已研究的比較透徹，并且在臨床應(yīng)用方面不斷獲得新的研究成果。多數(shù)毒力因子都具有良好的免疫原性，比如將白喉類毒素結(jié)合到莢膜多糖上增強(qiáng)其抗原性，為疫苗的研制打開(kāi)了新思路。近年來(lái)，毒力相關(guān)的基因逐步成為研究重點(diǎn)，包括編碼結(jié)構(gòu)性毒力因子的基因、腸毒素基因和某些調(diào)節(jié)基因。這些基因主要存在于沙門氏菌的染色體和質(zhì)粒中，因此毒力質(zhì)粒和毒力島等方面的研究不斷深入，成為沙門氏菌研究的熱點(diǎn)之一。目前，關(guān)于沙門氏菌已知的5個(gè)毒力島研究較為清楚，近期也有新的毒力島被鑒定出來(lái)，是否還有其他潛在的毒力島還有待進(jìn)一步研究。利用基因敲除等方法除去沙門氏菌的毒力部分，獲得的減毒沙門氏菌可作為載體或佐劑，其應(yīng)用也十分廣泛，不斷開(kāi)發(fā)出新的生物制品，對(duì)預(yù)防沙門氏菌病及其他傳染病具有重要意義。減毒沙門氏菌將是現(xiàn)在到將來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)的重點(diǎn)研究對(duì)象之一。

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