崔宇超，彭永剛，馬興杰，崔尚金*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，臨床癥狀以死胎和母豬流產(chǎn)為主要特征[1]。目前，PCR是檢測PPV的一種主要技術(shù)。此外還有環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(LAMP)[2]和熒光定量PCR方法[3-4]。這些方法均是為了提高現(xiàn)有PCR的敏感性，但熒光定量PCR需要昂貴的定量PCR儀，LAMP容易形成氣溶膠污染，這些缺點限制了其在臨床中的簡便應(yīng)用。因此，本研究針對PPV VP2基因，建立一種快速、敏感、特異的納米PCR檢測技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 病毒核酸和病料樣品 豬的主要病毒核酸包括PPV BQ-C株DNA，豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)SH株DNA，豬捷申病毒(PTV-8)cDNA，豬偽狂犬病毒(PRV)JL株DNA，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)HB株cDNA，豬瘟病毒(CSFV)cDNA均由本實驗室保存；病料樣品為黑龍江、河北和河南3個省份的43份臨床疑似PPV感染組織樣品，主要包括發(fā)病豬的心、肝、脾、肺、腎等組織。

1.2 主要試劑 PrimeSTARRHS DNA高保真酶、DL2000 Marker、DNA A-Tailing Kit、pMD18-T 載體、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、2×GC bufferⅡ購自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)MEGA公司；DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；納米PCR試劑盒購自山東大正醫(yī)療器械股份有限公司。

1.3 引物設(shè)計 參照GeneBank中登錄的PPV BQ株序列的VP2基因，應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計擴增PPV VP2基因全長序列的引物，通過與已公布的VP2基因全長序列進行比對后篩選保守區(qū)域設(shè)計擴增472 bp片段的引物。引物由哈爾濱博士生物公司合成(表 1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 VP 2重組質(zhì)粒模板的制備 以PPV BQ-C株細(xì)胞培養(yǎng)物提取的DNA為模板，以P1/P2為引物，利用PrimerSTAR高保真酶擴增VP2基因全長序列，并將其克隆至pMD18-T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-VP2，測序正確后作為PCR的陽性模板。

1.5 納米PCR的建立以及條件優(yōu)化 根據(jù)文獻(xiàn)[5]的方法，將納米PCR反應(yīng)體系預(yù)設(shè)定為：2×nano buffer 6 μL，P3/P4(10 μmol/L)0.6 μL，pMD-VP2(100 ng/μL)0.8 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O補至12 μL；反應(yīng)條件預(yù)設(shè)定為：94℃5 min；94℃30 s、50℃30 s、72℃40 s，30個循環(huán)；72℃7 min。普通PCR反應(yīng)體系中，緩沖液為不含有納米顆粒的2×GC bufferⅡ，同時添加dNTP，其他的反應(yīng)試劑和反應(yīng)條件與優(yōu)化的納米PCR相同。

利用溫度梯度PCR儀設(shè)置溫度為46℃～55℃，間隔1℃，進行退火溫度優(yōu)化，反應(yīng)體系和其他反應(yīng)條件均相同。引物(初始濃度為10 μmol/L)的使用體積從 0.2 μL 到 1.2 μL 進行優(yōu)化，間隔 0.2 μL，優(yōu)化的各組引物的終濃度為1/6 μmol/L～6/6 μmol/L，反應(yīng)條件以優(yōu)化后的退火溫度為準(zhǔn)。

1.6 敏感性試驗 陽性模板測定濃度后根據(jù)濃度計算拷貝數(shù)，10倍倍比稀釋后得到濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品。分別利用納米PCR和普通PCR對倍比稀釋的陽性模板進行擴增，以比較二者的敏感性。重復(fù)4次。

1.7 特異性試驗 應(yīng)用納米PCR分別對PPV、PCV2和PRV的DNA以及PTV-8、PRRSV和CFSV的cDNA進行檢測，以此驗證納米PCR方法的特異性。試驗重復(fù)進行4次。

1.8 納米PCR與普通PCR對臨床樣品的檢測比較將43份臨床組織樣品分別剪碎、研磨，參照基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，分別應(yīng)用納米PCR和普通PCR對提取的DNA進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 陽性模板的制備 以PPV細(xì)胞培養(yǎng)物提取的DNA作為模板，擴增VP2基因全長序列，獲得產(chǎn)物為1758 bp。將其經(jīng)過膠回收純化后連接到pMD18-T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，并且測序正確，將其命名為pMD-VP2，作為PCR的陽性模板。

2.2 納米PCR的建立以及條件優(yōu)化經(jīng)過 經(jīng)各種條件的優(yōu)化，最終確定納米PCR體系：2×nano buffer 6 μL，P3/P4(10 μmol/L)0.6 μL(引物終濃度為 1/2 μmol/L)，模板(100 ng/μL)0.8 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O 補至 12 μL；反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94℃ 30 s、48℃ 30 s、72℃ 40 s，30個循環(huán)；72℃7 min。普通PCR反應(yīng)體系中添加4.5 μL 2×GC bufferⅡ和 1.5 μL dNTP，其他試劑和反應(yīng)條件同納米PCR。

2.3 敏感性試驗 構(gòu)建的重組質(zhì)粒測定其濃度為100 ng/μL，換算成拷貝數(shù)濃度為 4×1010拷貝 /μL。將重組質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋，得到濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品(4 拷貝 /μL～4×1010拷貝 /μL)。納米 PCR 的最低檢出量為4拷貝/μL(圖1A)，而普通PCR的最低檢出量為4×103拷貝/μL(圖1B)，表明納米PCR比普通PCR敏感1000倍。

圖1 納米PCR(A)和普通PCR(B)的敏感性試驗Fig.1 Sensitivity tests of the nano PCR(A)and conventional PCR(B)

2.4 特異性試驗 應(yīng)用納米PCR對豬的6種主要病毒DNA或者cDNA進行檢測，只有以PPV DNA為模板時擴增出472 bp特異性條帶，而其他5種病毒核酸檢測結(jié)果均呈陰性(圖2)，表明該納米PCR具有良好的特異性。

圖2 納米PCR的特異性試驗Fig.2 Specificity test of the nano PCR

2.5 納米PCR與普通PCR對臨床樣品的檢測比較分別應(yīng)用納米PCR和普通PCR對3個省份送檢的43份臨床樣品進行檢測。結(jié)果顯示，納米PCR和普通PCR檢測PPV陽性率分別為95%(41/43)和72%(31/43)，表明該納米PCR比普通PCR更加敏感，適用于低含量PPV臨床樣品的檢測。

3 討 論

目前，檢測PPV的PCR主要包括普通PCR和熒光定量PCR。在臨床應(yīng)用中，普通PCR較為常用，但其敏感性不顯著，熒光定量PCR較為精準(zhǔn)，但需要精密的儀器并且操作程序復(fù)雜。納米PCR是一種新型的PCR技術(shù)，它比普通PCR更加敏感，比熒光定量PCR更加方便快捷。納米PCR緩沖液中含有粒徑為1 nm～100 nm的納米金屬顆粒，當(dāng)反應(yīng)時納米金屬顆粒懸浮在液體里形成納米流體，這種納米流體相對于普通流體具有更強的導(dǎo)熱性，高導(dǎo)熱性能夠加快溫度升高和下降的速度，使反應(yīng)體系快速達(dá)到目標(biāo)溫度，減少在非目標(biāo)溫度的停留時間，增加特異性反應(yīng)時間，因而最終達(dá)到消除非特異性擴增，提高擴增效率和敏感性的目的[6-7]。本研究首次應(yīng)用納米PCR技術(shù)針對PPV VP2基因進行檢測，建立一種快速、敏感、特異的PPV檢測方法。本研究建立的納米PCR比普通PCR敏感1000倍。并且具有良好的特異性。

臨床中，在PPV感染初期或者后期病毒載量較低時，應(yīng)用納米PCR檢測PPV更加高效，適合于基層實驗室的使用。本研究中分別應(yīng)用納米PCR和普通PCR檢測臨床樣品，結(jié)果表明納米PCR比普通PCR更加敏感。該PPV納米PCR具有較高的敏感性和特異性，是一種高效的檢測手段，可以應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查，同時也為PPV的及時檢測、預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。

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