劉曉婧，王 芳，趙 權(quán)，于 力*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/牛羊傳染病研究創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150001)

阿卡斑病(Akabane disease，AKA)，又稱赤羽病，是由布尼病毒科布尼病毒屬辛波病毒群的阿卡斑病毒(Akabane virus，AKAV)引起的，以牛羊流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎及犢牛先天性關(guān)節(jié)彎曲和積水性無腦癥為特征[1]。AKA首次于1949年在日本暴發(fā)，目前AKA廣泛分布于澳大利亞、東南亞、亞洲東部、中東和非洲的熱帶和溫帶地區(qū)[2]。1994年，李昌琳等首次證明在我國大部分省份均存在AKA的流行[3]。1996年～1997年上海暴發(fā)該病，牛胎兒死亡率約占20%～30%，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[4-5]。次年，李其平等從上海地區(qū)采集的蚊、蠓等標(biāo)本中分離到3株AKAV[6]。該病在我國被列為二類動物傳染病。

AKAV為單鏈負(fù)股RNA病毒，其基因組由L、M和S 3個基因節(jié)段組成，分別編碼RNA-依賴的RNA聚合酶L、囊膜糖蛋白G1、G2、NSm和核衣殼蛋白N、NSs蛋白[7]。N蛋白具有高度保守性，并可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生良好的抗體反應(yīng)，適合用作該病毒的檢測抗原[8-9]。

目前，我國沒有商品化的檢測試劑盒，中和試驗是經(jīng)典的檢測方法，但耗時較長。本研究以純化的重組N蛋白和純化的全病毒作為包被抗原分別建立AKAV抗體的間接ELISA檢測方法，以中和試驗進(jìn)行比對。建立的AKAV抗體間接ELISA檢測方法為我國AKAV感染的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和防控技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 AKAV由云南畜牧獸醫(yī)研究院惠贈；247份現(xiàn)地牛血清于2013年分別采自湖北省(99份)、江蘇省(52份)和廣東省(96份)的不同牛群；BHK21細(xì)胞、AKAV鼠陽性血清、AKAV牛陽性血清、口蹄疫病毒(FMDV)陽性血清、牛流行熱病毒(BEFV)陽性血清和牛支原體M.leachii陽性血清、pET-28a(+)載體和E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 PrimeSTARRHS DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker均購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自Axygen公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG(IgG-HRP)和羊抗鼠IgG-HRP均購自Sigma公司；Ni-NTA Agarose和Chromatography Column純化柱均購自Qiagen公司；Prestained Protein Ladder購自MBI公司。

1.3 AKAVN蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)AKAV N基因序列設(shè)計表達(dá)引物，上游引物NU：5'-CGCGG ATCCATGGCAAATCAATTC-3'(BamHⅠ)，下游引物NL：5'-CCGCTCGAGTTAGATCTGGATACC-3'(XhoⅠ)。全長N基因PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pET-28a(+)分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化，獲得的陽性重組質(zhì)粒由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4 重組N蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將陽性重組菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳和western blot鑒定后進(jìn)行大量誘導(dǎo)。參照Qiagen蛋白純化手冊進(jìn)行N蛋白純化。BCA法測定蛋白濃度。

1.5 AKAV全病毒純化及鑒定 參照文獻(xiàn)[10]并適當(dāng)改進(jìn)。收獲60 h BHK21細(xì)胞培養(yǎng)物，4000 r/min離心30 min，將上清液中加入終濃度為8%PEG6000，4℃過夜，8000 r/min離心30 min取沉淀，20%～60%蔗糖不連續(xù)梯度32000 r/min離心3 h，取乳白色條帶，進(jìn)行SDS-PAGE和western blot鑒定。BCA法測定純化病毒的含量，作為包被抗原。

1.6 中和試驗篩選陰陽性血清 對采自湖北省、江蘇省和廣東省的247份牛血清進(jìn)行中和試驗檢測，具體方法參照AKA行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[11]及文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

1.7 間接ELISA檢測方法的反應(yīng)條件優(yōu)化 對ELISA工作條件進(jìn)行優(yōu)化，包括抗原包被濃度、封閉液和作用時間、樣品血清及酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)和作用時間、顯色液和顯色時間等。同時進(jìn)行重復(fù)性和特異性試驗。

1.8 臨界值的確定 為確定兩種ELISA檢測方法的判斷標(biāo)準(zhǔn)，采用受試者工作特征(ROC)曲線分析。選擇中和試驗檢測為陰性和陽性的247份血清進(jìn)行ELISA檢測。應(yīng)用ROC曲線確定陰性、陽性血清區(qū)分的最佳閾值。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果中各個切點的敏感性及特異性，計算Youden指數(shù)(Youden指數(shù)=敏感性+特異性-1)，并選擇Youden指數(shù)最大的切點為臨界值。可疑區(qū)間范圍選擇曲線上敏感性上升速度減緩而特異性下降明顯的折點和曲線基本呈水平到達(dá)點(1,1)坐標(biāo)的折點，兩折點之間包含了較多的陰陽性重疊區(qū)域[13]。

1.9 特異性試驗 采用建立的兩種ELISA方法對AKAV牛陽性血清、FMDV陽性血清、BEFV陽性血清和牛支原體M.leachii陽性血清進(jìn)行ELISA檢測，確定兩種ELISA檢測方法的特異性。

1.10 臨床血清樣品檢測 分別用重組N蛋白和AKAV全病毒作為抗原，以間接ELISA方法對現(xiàn)地血清進(jìn)行檢查，并與中和試驗結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 重組N蛋白的表達(dá)與純化 將全長N基因克隆于表達(dá)載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和western blot檢測表明，重組N蛋白獲得表達(dá)，大小與預(yù)期(26.1 ku)一致，其與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清呈特異性免疫反應(yīng)(圖1)。經(jīng)鎳柱純化后測定蛋白濃度為0.24 mg/mL。

圖1 重組N蛋白的SDS-PAGE(A)和western blot(B)鑒定Fig.1 The SDS-PAGE(A)and western blot(B)analysis of the expressed N recombinant protein

2.2 AKAV的純化與鑒定 AKAV全病毒經(jīng)差速離心和蔗糖密度梯度離心后，進(jìn)行SDS-PAGE和western blot鑒定，結(jié)果顯示純化的病毒與AKAV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，其中N蛋白條帶的反應(yīng)明顯。測定的蛋白濃度為0.64 mg/mL。

2.3 中和試驗 對采自湖北省、江蘇省和廣東省的247份牛血清進(jìn)行中和試驗檢測，共篩選出73份陽性血清，174份陰性血清，表明這3個省區(qū)牛群中均有AKA感染(表1)。

表1 中和試驗檢測現(xiàn)地牛血清的結(jié)果Table 1 The neutralization tests of bovine diagnose samples

2.4 間接ELISA檢測方法的最佳反應(yīng)條件 經(jīng)過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定的最佳工作條件為：AKAV重組N蛋白和AKAV全病毒的最佳包被濃度分別為 3 μg/mL和 6 μg/mL，4℃包被過夜，1%BSA 37℃封閉1 h。待檢血清用PBST做1∶100稀釋，37℃作用1 h；羊抗鼠(或兔抗牛)IgG-HRP(1∶5000)為二抗37℃作用1 h；加入TMB底物室溫避光顯色10 min測定OD450nm值。批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗顯示，兩種ELISA檢測方法的OD450nm值變異系數(shù)均小于10%。

2.5 臨界值確定 應(yīng)用ROC曲線對247份血清進(jìn)行ELISA檢測的結(jié)果進(jìn)行分析，選擇圖中最靠近左上方的點(圖2)。最終確定N-ELISA檢測方法最佳臨界值為0.36，可疑范圍選擇在0.35～0.42之間，其敏感性為0.804～1。即血清樣品OD450nm值≥0.42為抗體陽性，OD450nm值<0.35為抗體陰性；AKAVELISA檢測方法最佳臨界值為0.46，可疑范圍選擇在0.46～0.73之間，其敏感性為0.591～1。即血清樣品OD450nm值≥0.73為抗體陽性，OD450nm值<0.46為抗體陰性。

圖2 間接ELISA檢測牛血清ROC分析Fig.2 ROC analysis of the bovine sera detected by indirect ELISA

2.6 特異性試驗 采用建立的N-ELISA和AKAVELISA方法對FMDV、BEFV和牛支原體M.leachii的陽性血清進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，重組N蛋白和AKAV與上述3種病原的陽性血清均無交叉反應(yīng)，這兩種ELISA方法均具有良好的特異性(表2)。

2.7 臨床血清樣品檢測 對采自湖北省、江蘇省、廣東省的247份牛血清進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果顯示，N-ELISA和AKAV-ELISA檢測的抗體陽性率分別為23%和27.9%，與中和試驗的符合率，分別為72.5%和 76.5%(表 3)。

表2 特異性試驗結(jié)果Table 2 The specificity tests of the indirect ELISA

表3 N-ELISA和AKAV-ELISA的符合率Table 3 The comparison of detection between N-ELISA and AKAV-ELISA

3 討 論

目前我國對AKA的研究還處于起步階段，缺少有效的商品化檢測試劑盒，也無用于預(yù)防該病的疫苗。徐樹蘭等建立了AKA重組N蛋白抗原間接ELISA檢測方法，但未見后續(xù)報道[14]。目前市場上主要是用法國ID-VET公司研制的競爭ELISA試劑盒，該試劑盒價格昂貴，不適合用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查和檢測。

AKAV N蛋白中存在保守的抗原表位，可以刺激機體產(chǎn)生抗體，因此通過檢測N蛋白抗體可以診斷該病的流行[15]。由于我國尚未發(fā)現(xiàn)辛波病毒群的其他病毒，因此N蛋白可以用于AKAV的血清學(xué)診斷。本研究表達(dá)的重組N蛋白為可溶性蛋白，并且包含載體的6×His標(biāo)簽，因此可以采用Ni-NTA Agarose親和層析方法對融合蛋白進(jìn)行純化。所獲得的蛋白經(jīng)western blot檢測具有良好的免疫學(xué)活性。此外，以重組N蛋白作為診斷抗原建立的ELISA試劑盒，其生物安全性好，生產(chǎn)成本低，易于規(guī)?；a(chǎn)，便于推廣應(yīng)用。

建立間接ELISA檢測方法的關(guān)鍵是抗原的質(zhì)量。本實驗除了用純化的重組N蛋白作為抗原，也嘗試了用純化的AKAV全病毒作為包被抗原。用兩種ELISA檢測方法同時檢測牛血清，并與中和試驗進(jìn)行符合率的比較，結(jié)果表明，N-ELISA和AKAVELISA與中和試驗的符合率分別為72.5%和76.5%。兩種方法均具有較好的實用價值，但鑒于使用全病毒作為抗原存在生物安全性問題，因此建議優(yōu)先選擇N-ELISA應(yīng)用于臨床血清樣品的檢測及流行病學(xué)調(diào)查研究。

[1]徐淑菲，孔繁德.赤羽病病原學(xué)研究進(jìn)展[J].福建畜牧獸醫(yī)，2005，27(5)：25-26.

[2]Kirkland P D,Barry R D,Harper P A,et al.The development of Akabane virus-induced congenital abnormalities in cattle[J].Vet Rec,1988,122(24):582-586.

[3]李昌琳，封啟民，張瑞珍，等.我國赤羽病血清學(xué)調(diào)查報告[J].動物檢疫，1994，11(2)：35-36.

[4]劉煥章，李樹清.赤羽病瓊脂免疫擴散試驗診斷方法的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2000，22(4)：299-301.

[5]劉煥章，吳東來，胡守萍，等.赤羽病、中山病和茨城病流行病學(xué)調(diào)查初報[J].中國奶牛，2002，5：46-47.

[6]李其平，周立橋，姚龍濤，等.阿卡斑(赤羽病)病毒的分離與初步鑒定[J].中國動物檢疫，2000，17(7)：27-29.

[7]Akashi H,Kaku Y,Kong Xiang-gang,et al.Sequence determination and phylogenetic analysis of the Akabane bunyavirus S RNA genome segment[J].J Gen Virol,1997,78:2847-2851.

[8]Lee J K,Park J S,Choi J H,et al.Encephalomyelitis associated with Akabane virus infection in adult cows[J].Vet Pathol,2002,39(2):269-273.

[9]Stram Y,Brenner J,Braverman Y,et al.Akabane virus in Israel:a new virus lineage[J].Virus Res,2004,104(1):93-97.

[10]Taylor W P,Mellor P S.The distribution of Akabane virus in the Middle East[J].Epidemiol Infect,1994,113(1):175-185.

[11]SN/T 1128-2007.赤羽病檢疫技術(shù)規(guī)范.中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[S].

[12]劉煥章，李樹清，吳東來，等.赤羽病微量病毒中和試驗診斷方法的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2001，23(1)：53-55.

[13]陳衛(wèi)中，倪宗瓚，潘曉平，等.用ROC曲線確定最佳臨界點和可疑值范圍[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，32(7)：729-731.

[14]徐樹蘭，李少英，辛九慶，等.赤羽病病毒核衣殼蛋白抗體間接ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2006，36(11)：868-875.

[15]Blacksell S D,Lunt R A.Rapid identification of Australian bunyavirus isolates belonging to the Simbu serogroup using indirect ELISA for mats[J].J Virol Methods,1997,66(1):123-133.