肖 麗，陳立青，戴方偉，宋曉明，郭紅剛，盧領群，呂 宇，薩曉嬰

(1. 浙江省醫(yī)學科學院 實驗動物與安全性評價重點實驗室, 杭州 310013；2. 杭州師范大學實驗動物中心, 杭州 310036)

長爪沙鼠作為實驗動物應用于醫(yī)學領域已有較長時間，其獨特的解剖學、生理學和行為學等特征使其在微生物感染、營養(yǎng)代謝病、腦血管疾病、自發(fā)性腫瘤和慢性鉛中毒等諸多研究中應用廣泛[1]。更深入細致的生理學特性研究將有助于拓展該動物在人類疾病實驗動物模型研究中發(fā)揮更大的應用價值，也有助于加快長爪沙鼠的實驗動物化進程。目前，有關長爪沙鼠生殖特性的文獻已有報道[2,3]，但僅包括性成熟時間、產(chǎn)仔數(shù)量等概況，關于長爪沙鼠動情周期血清激素變化和卵泡發(fā)育的研究，國內(nèi)未見報道，而陸續(xù)開展的長爪沙鼠生殖生理、胚胎移植等研究亟需上述背景信息?；诖?，本文對長爪沙鼠動情周期各階段卵巢形態(tài)、卵泡數(shù)量和血清激素水平等進行了觀察測定，以期逐步揭示其生殖機理，為長爪沙鼠的進一步應用提供基礎參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

未交配成年清潔級雌性長爪沙鼠，4月齡，50 g～60 g，由浙江省實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于12 h光照和12 h黑暗的環(huán)境中，溫度20 ℃～26℃，濕度40%～70%，有通風系統(tǒng)保持室內(nèi)空氣流暢，動物自由攝食和飲水。生產(chǎn)許可證號為SCXK(浙)2008-0034，使用許可證號為SYXK(浙)2008-0114，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 試劑和儀器

主要試劑為生理鹽水、蘇木精-伊紅染液、ELISA試劑盒(購自上海博谷生物科技有限公司)等。主要儀器有Leica CM1900冰凍切片機(上海來卡儀器有限公司)、Leica DM2500熒光顯微鏡成像系統(tǒng)(上海來卡儀器有限公司)、Bio-Rad Model 680酶標儀、細胞分類計數(shù)器、細胞計數(shù)板等。

1.3 實驗方法

1.3.1 長爪沙鼠動情周期的確定：每天早上8:30保定動物，以30 μL生理鹽水輕輕沖洗長爪沙鼠陰道后吸出，加至潔凈的96孔板中直接鏡檢，觀察細胞的種類和形態(tài)[4]，根據(jù)下述判定標準進行動情周期判斷。①動情前期：持續(xù)時間為(21.0±10.0)h，陰道涂片中可見大量橢圓形的有核上皮細胞，偶見少量角化細胞；②動情期：持續(xù)時間為(25.8±9.8)h，陰道涂片可見大量外形不規(guī)則的角化上皮細胞，偶有少量有核上皮細胞；③動情后期：持續(xù)時間為(17.6±8.7)h，陰道涂片不規(guī)則角化上皮細胞、有核上皮細胞和淋巴細胞均可見，且比例相當；④動情間期：持續(xù)時間為(48.0±37.8)h，可見大量淋巴細胞及少量有核上皮細胞[4]。

1.3.2 標本采集：待確定長爪沙鼠的動情周期后，眼球采血，采血時防止溶血和雜質污染。室溫放置30 min，2 500 r/min離心10 min，分離血清，分裝成2個EP管，-20℃ 保存。室溫下，采用頸椎脫臼法處死長爪沙鼠，剝離雙側卵巢，用 4%甲醛溶液固定后常規(guī)石蠟包埋切片，置于Leica切片機上連續(xù)切片，厚度為5 μm，蘇木精-伊紅染色后進行顯微鏡觀察并拍照。

1.3.3 卵泡的計數(shù):取長爪沙鼠的雙側卵巢，固定后進行石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下計數(shù)各樣本切片的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡和黃體的數(shù)目。哺乳類動物隨著動情周期變化卵巢內(nèi)會出現(xiàn)不同數(shù)量的卵泡和黃體，按下述方法進行判斷[5]。①原始卵泡：靠近白膜，中央有一個卵細胞，其外周為單層扁平的卵泡細胞；②初級卵泡：初級卵母細胞體積較大，單層或多層(5～6層)立方形或柱狀卵泡細胞；③次級卵泡：卵泡體積擴大，形成卵丘，卵泡細胞增至6～12層；④成熟卵泡：卵泡體積很大，并向卵巢表面突出，顆粒層很薄，卵丘非常明顯；⑤黃體：排卵后殘留在卵巢內(nèi)的卵泡壁塌陷，卵泡膜的結締組織和血管等伸入到顆粒層，在LH的作用下演變成體積較大，富含毛細血管并具有分泌功能的細胞團。

表1 長爪沙鼠動情周期各時相的卵泡和黃體數(shù)量

1.3.4 性激素水平的測定:用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA法)[6,7]定量測定各組長爪沙鼠血清催乳素(PRL)、雌二醇(E2)、促卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 長爪沙鼠動情周期各階段陰道涂片的觀察

長爪沙鼠動情周期中各時相陰道涂片的特點：①動情前期陰道涂片主要以有核上皮細胞為主(圖1A)；②動情期主要為不規(guī)則的角化細胞，圖1B；③動情后期可觀察到不規(guī)則角化上皮細胞、有核上皮細胞和淋巴細胞均存在，以角化細胞、淋巴細胞兩者為主，圖1C；④動情間期時主要為淋巴細胞，偶有少量有核上皮細胞(圖1D)(圖1見彩插2)。

2.2 動情周期卵巢形態(tài)觀察和卵泡數(shù)量的變化

由表1可見，長爪沙鼠動情周期各時相原始卵泡數(shù)量自動情前期開始呈現(xiàn)先減少后增多的趨勢，初級卵泡和次級卵泡數(shù)量在各時相差異未見顯著性，成熟卵泡數(shù)量先增多再減少，無統(tǒng)計學差異。長爪沙鼠動情前期和動情期的卵泡數(shù)量較多，其中動情前期初級卵泡數(shù)量居多，次級卵泡和成熟卵泡開始生成，見圖2A。動情期的成熟卵泡數(shù)量多于動情周期其他時相，并逐漸有新的黃體形成(圖2B)。動情后期原始卵泡和初級卵泡相比于其他時相有所增多，其中初級卵泡較各時相最多，黃體數(shù)量增多，見圖2C。動情間期原始卵泡和初級卵泡較多，黃體數(shù)量顯著性低于動情前期、動情期和動情后期(P<0.05)，且較大呈片狀，見圖2D(圖2見彩插2)。動情周期各時相間各級卵泡數(shù)量差異未見顯著性。

2.3 動情周期血清PRL、E2、 FSH 和LH水平的變化

長爪沙鼠血清PRL水平從動情前期、動情期、動情后期至動情間期分別為(3.43±0.27)ng/mL、(5.11±0.27)ng/mL、(5.15±0.37)ng/mL、(7.58±0.18)ng/mL，呈逐漸升高，動情間期PRL水平與其他各組差異顯著(P<0.05)，見圖3A。血清E2水平從動情前期至動情間期分別為(42.45±2.83)mIU/mL、(23.29±2.20)mIU/mL、(20.42±0.60)mIU/mL、(22.42±0.25)mIU/mL，由前期到間期逐漸減少，動情前期血清E2水平顯著性高于其他各組(P<0.05)，見圖3B。長爪沙鼠血清FSH水平(圖3C)從動情前期到動情間期分別是(4.47±0.45)mIU/mL、(2.87±0.37)mIU/mL、(1.96±0.07)mIU/mL、(0.91±0.04)mIU/mL，整體呈下降趨勢，動情前期FSH水平顯著性高于動情后期和動情間期(P<0.05)。血清LH水平從動情前期到動情間期分別是(4.77±0.52)mIU/mL、(7.07±0.48)mIU/mL、(4.81±0.38)mIU/mL、(11.11±0.31)mIU/mL，呈逐漸升高，至動情間期達到峰值，并顯著性高于其他各組(P<0.01)，見圖3D。

(A)圖為血清催乳素(PRL)水平，(B)圖為血清雌二醇(E2)水平，(C)圖為血清促卵泡刺激素(FSH)水平，(D)圖為血清黃體生成素(LH)水平。P為動情前期，E為動情期，M為動情后期，D為動情間期。

3 討論

本文根據(jù)雌性嚙齒類動物在動情周期的不同時相，陰道黏膜受卵巢雌、孕激素的影響會發(fā)生典型變化的原理[8]，用直接鏡檢法計數(shù)角化細胞，統(tǒng)計陰道脫落細胞的類型及比例，從而確定長爪沙鼠動情周期的四個時相[4]，并采用ELISA法測定長爪沙鼠動情周期各時相性激素的變化。長爪沙鼠動情周期期間血清中促性腺激素(FSH和LH)、催乳素(PRL)和雌二醇(E2)的動態(tài)變化與動情周期各時相的卵泡和黃體生成密切相關。在動情前期，血清E2增多，通過對下丘腦的反饋作用調(diào)節(jié)GnRH和促性腺激素大量分泌，引起FSH在動情前期含量急劇增高，促進卵巢卵泡的快速生長。血清LH水平從動情前期到動情間期呈逐漸升高，先在動情期達到一個峰，動情后期有所下降，至動情間期達到最高峰(圖3D)。E2通過正反饋作用作用于下丘腦的周期中樞，引起排卵前LH增高[9]。在動情間期血清E2的含量稍微增加， LH大量增多(圖3)，在LH峰出現(xiàn)之后，卵泡的內(nèi)膜細胞和顆粒細胞開始黃體化[9]，在動情前期生成大量黃體(表1)。FSH從動情前期到動情間期，呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，動情前期達到峰值(圖3C)，為卵泡發(fā)育和LH的生成奠定了基礎。FSH可促進卵巢卵泡的生長，促進卵泡顆粒細胞的增生和雌激素的合成和分泌，并可刺激卵泡細胞上LH受體產(chǎn)生，而LH可促進卵泡的成熟和排卵，刺激卵泡內(nèi)膜細胞產(chǎn)生雄激素(為顆粒細胞合成雌激素提供前體物質)，并可促進排卵后的顆粒細胞黃體化，維持黃體細胞分泌孕酮[9]。FSH和LH在動情周期中相互協(xié)調(diào)，對動情周期中卵泡發(fā)育和黃體生成至關重要。PRL在未經(jīng)交配的嚙齒類動物體內(nèi)有促黃體溶解的功能[9]。血清PRL在動情間期達到峰值，當PRL血清濃度達到最高，黃體逐漸退化，卵巢內(nèi)的黃體數(shù)量達到最低(表1)。動情間期黃體的退化為新一周期的黃體生成奠定了基礎，也為新一周期的卵泡發(fā)育提供了空間。長爪沙鼠動情周期中出現(xiàn)的FSH和E2峰值的時相與大小鼠一致[7,10,11]。而PRL和LH出現(xiàn)峰值的時相與大小鼠有差異，大小鼠的血清PRL和LH均在動情前期出現(xiàn)峰值[7,10, 12]。另外，關于長爪沙鼠動情周期血清PRL、FSH和E2水平出現(xiàn)峰值的時相，Lv XH等[6,7]的結果與本研究結果相同。Lv XH等[7]在長爪沙鼠動情期測到LH的峰值，本研究在動情間期測得LH峰值，LH動情周期各時相的血清含量變化與黃體計數(shù)的結果一致，動情間期血清LH出現(xiàn)峰值，促進黃體大量生成，黃體的數(shù)量在動情前期達到最多。動情周期各時相中各級卵泡數(shù)量未見顯著性差異，有待進一步研究。

隨著長爪沙鼠科研用途的不斷擴展，動情周期各時相卵泡數(shù)量與血清激素水平變化規(guī)律的揭示將完善長爪沙鼠生殖生理特性，為長爪沙鼠應用于婦科、產(chǎn)科和計劃生育等醫(yī)學科學研究提供參考。

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