秦 瑤，程樹(shù)軍，黃健聰，黃 玲，陳 彧

(1. 廣東出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣州 510623; 2. 新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，烏魯木齊 830063)

歐盟化妝品動(dòng)物實(shí)驗(yàn)禁令的發(fā)布和實(shí)施，為檢測(cè)機(jī)構(gòu)在產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)中建立科學(xué)合理的體外替代方法提出了要求。既然化妝品眼刺激評(píng)價(jià)的Draize兔眼試驗(yàn)已被法規(guī)禁止，那么在多種有效的體外方法中選擇建立整合應(yīng)用策略是比較理想的模式，這些方法包括離體雞眼試驗(yàn)(ICE)、雞胚絨毛膜尿囊膜試驗(yàn)(HET-CAM、CAMVA、CAMTB)、牛角膜渾濁及通透度試驗(yàn)(BCOP)、短時(shí)間暴露試驗(yàn)(STE)、熒光素漏出試驗(yàn)(FL)等[1-3]。本實(shí)驗(yàn)研究組合兩種有效的眼刺激體外方法——雞胚絨毛膜尿囊膜血管試驗(yàn)(CAMVA)和BCOP試驗(yàn)，對(duì)60種個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品眼刺激性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比對(duì)，建立CAMVA-BCOP組合策略，為個(gè)人護(hù)理用品的眼刺激性的體外評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 樣品

市售化妝品合計(jì)60種，分為3類(lèi)，清潔沐浴類(lèi)產(chǎn)品(沐浴露、洗發(fā)水、清潔液等)22種，眼部用產(chǎn)品(粉底、眼線、眼霜、睫毛膏、眉筆等)17種和護(hù)膚類(lèi)產(chǎn)品(防曬霜、防皺霜、祛斑、植物精油等)21種。

1.2 主要材料、試劑及儀器

SPF級(jí)白萊杭雞受精雞胚(購(gòu)于新興大華農(nóng)禽蛋有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(粵)2008-0019，牛眼球取自廣州地區(qū)屠宰場(chǎng)，普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(粵)2008-0002。含酚紅及不含酚紅MEN培養(yǎng)基(含1% FBS和L-谷氨酰胺)、HBSS、熒光素鈉均購(gòu)自Sigma公司，含Ca2+、Mg2+的DPBS，10%氫氧化鈉(廣州化學(xué)試劑廠)，“O”形特富龍環(huán)(孔徑0.8 mm)，角膜濁度儀(德國(guó)BASF-OP3.0)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)，培養(yǎng)箱(德國(guó)Memmert)等。

1.3 CAMVA方法及眼刺激性分類(lèi)

將1 d齡雞胚置于培養(yǎng)箱37℃孵育，于第4天在雞胚窄端鉆一小孔，抽取約3 mL蛋清后用火膠棉封住小孔。在雞胚位置的上方開(kāi)約5 mm×10 mm的矩形小窗并移除蛋殼，暴露雞胚，以保鮮膜覆蓋。隨后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育。第14天，取出雞胚，擴(kuò)大觀察窗，于絨毛尿囊膜上放置“O”形特富龍環(huán)，取40 μL(固體40 mg)不同濃度受試物加入環(huán)內(nèi)，37℃孵育。30 min后，觀察血管變化，計(jì)數(shù)陽(yáng)性反應(yīng)(出現(xiàn)溶血、血管消失、血管凝固等)雞胚個(gè)數(shù)，最后計(jì)算RC50，即引起一半雞胚出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的受試物濃度。如果樣品RC50>3%，判定為無(wú)刺激性，≤3%，則為有刺激性[4]。

1.4 BCOP方法及眼刺激性分類(lèi)

參考OECD指南437，取新鮮牛眼球切取角膜，將其裝配于專(zhuān)用支架中。前后室均填滿(mǎn)無(wú)酚紅MEM，于(32±1)℃培養(yǎng)箱平衡1 h后用濁度儀讀數(shù)角膜濁度本底值。移除前室培養(yǎng)基后加入750 μL未稀釋液體受試物(固體為20%懸液)，孵育10 min(固體為4 h)，用含酚紅MEM沖洗至樣品無(wú)殘留。前室重新填滿(mǎn)無(wú)酚紅MEM后返回培養(yǎng)箱孵育2 h(固體無(wú)需后孵育)后讀取終末濁度值。去除前室培養(yǎng)基，加入1 mL 0.4%(固體為0.5%)由含Ca2+、Mg2+DPBS配制的熒光素鈉溶液，孵育90 min。收集后室全部液體，混勻后取360 μL在490 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度值。根據(jù)公式計(jì)算體外刺激評(píng)分值(in vitro irritancy score, IVIS)：IVIS=濁度值 + 15 × 吸光度。每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)角膜。IVIS≤3，預(yù)測(cè)無(wú)刺激性，3～55預(yù)測(cè)刺激性(包括2A和2B類(lèi))，>55預(yù)測(cè)嚴(yán)重刺激性[5]。

1.5 Draize兔眼試驗(yàn)

成年健康家兔，在其中一只眼睛結(jié)膜囊滴入0.1 mL受試物，另一只眼睛作為對(duì)照，于染毒后24 h、48 h、72 h、4 d、7 d觀察眼睛結(jié)膜、角膜、虹膜反應(yīng)。根據(jù)改良最大平均得分MMAS (modified maximum average score)進(jìn)行分類(lèi)：MMAS≤2.5為無(wú)刺激性， 2.5～25為輕刺激性，25～50為中度刺激性，>50為嚴(yán)重刺激性/腐蝕性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

比較不同方法結(jié)果對(duì)物質(zhì)分類(lèi)是否具有一致性，采用Kappa一致性檢驗(yàn) (Kappa≥0.75一致性好；0.75

2 結(jié)果

60種產(chǎn)品的體外測(cè)試和動(dòng)物測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)Draize試驗(yàn)的樣品，結(jié)果為42種無(wú)刺激性，11種微弱刺激性、5種中等刺激性和2種嚴(yán)重刺激性。CAMVA試驗(yàn)結(jié)果為41種無(wú)刺激性，19種為有刺激性；BCOP試驗(yàn)結(jié)果為35種無(wú)刺激性，21種輕-中刺激性，4種嚴(yán)重刺激性。

以體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，參考替代方法驗(yàn)證的準(zhǔn)則[2]。CAMVA方法可以區(qū)分41種無(wú)刺激性樣品，特異性為97.6%(41/42)，可區(qū)分全部18種有刺激性的樣品，敏感性為100%(18/18)，但對(duì)刺激程度的預(yù)測(cè)效果不理想，總的分類(lèi)一致性達(dá)到98.3%(59/60)，Kappa=0.890。陽(yáng)性預(yù)測(cè)性為94.7%(18/19)，陰性預(yù)測(cè)率為100%(41/41)，假陽(yáng)性率為2.4%(1/42)，假陰性率為0%(0/18)。

BCOP方法對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的預(yù)測(cè)，總敏感性為100%(18/18)，其中嚴(yán)重/腐蝕性刺激性預(yù)測(cè)，敏感性為100%(2/2)，對(duì)于中度-輕度刺激性的區(qū)分，敏感性為95.8%(14/16)。BCOP可以區(qū)分35種無(wú)刺激性樣品，特異性為83.3%(35/42)。總的分類(lèi)一致性達(dá)到85%(51/60)，其中陽(yáng)性預(yù)測(cè)性(含輕度,中度和嚴(yán)重刺激性)為72%(18/25)，陰性預(yù)測(cè)性為100%(35/35)。假陽(yáng)性率為20.0%(7/35)，假陰性率為0%(0/18)。分類(lèi)不一致的情況是將1種輕度和1種中度刺激性誤分類(lèi)為嚴(yán)重刺激性，7種無(wú)刺激性誤分類(lèi)為輕-中度刺激嚴(yán)重刺激性。

試驗(yàn)結(jié)果表明，CAMVA區(qū)分了41種無(wú)刺激性樣品，18種有刺激性樣品，與兔眼試驗(yàn)一致性達(dá)到98.3%(59/60)，但對(duì)于有刺激性樣品并無(wú)確切的程度對(duì)應(yīng)區(qū)分。BCOP鑒別了35種無(wú)刺激性樣品和25種有刺激性樣品，總的分類(lèi)一致性為85%，一致性檢測(cè)Kappa=0.743，低于CAMVA法，主是原因是BCOP方法將較多的無(wú)刺激類(lèi)歸為不可預(yù)測(cè)類(lèi)。采用CAMVA-BCOP的組合方法(表2)：對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的預(yù)測(cè)總敏感性為100%(18/18)，其中嚴(yán)重刺激性預(yù)測(cè)敏感性為100%(2/2)，對(duì)于中度-輕度刺激性的區(qū)分，敏感性為100%(15/15)，對(duì)于無(wú)刺激性樣品預(yù)測(cè)的特異性為97.6%(41/42)?？偟姆诸?lèi)一致性達(dá)到98.3%(59/60)，其中陽(yáng)性預(yù)測(cè)性為100%(18/18)，陰性預(yù)測(cè)性為100%(35/35)。假陽(yáng)性率為2.4%(1/42)，假陰性率為0%(0/18)。

表1 體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 組合方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 組合CAMVA-BCOP方法的眼刺激試驗(yàn)策略

3 討論

傳統(tǒng)Draize兔眼試驗(yàn)存在評(píng)分主觀性、重復(fù)性差、耗時(shí)、方法殘忍等不足，無(wú)法滿(mǎn)足產(chǎn)品精確定量評(píng)價(jià)的要求。近20多年來(lái)，已開(kāi)發(fā)了多種體外方法用于替代兔眼試驗(yàn)，不僅可以減少體內(nèi)試驗(yàn)的不足，而且遵循了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)減少優(yōu)化和替代的3R原則。但是，鑒于體內(nèi)眼刺激反應(yīng)尚包括眼瞼、結(jié)膜和角膜的反應(yīng)，僅使用單一體外方法無(wú)法完全模擬體內(nèi)反應(yīng)，不同方法適用范圍也存在差異，體外方法還不能很好地檢測(cè)損傷后的修復(fù)作用。因此考慮組合兩個(gè)或兩個(gè)以上體外方法建立整合測(cè)試策略，以覆蓋眼刺激性反應(yīng)累及的范圍和程度。

雞胚絨毛膜毛尿囊膜結(jié)構(gòu)與眼結(jié)膜相似，CAMVA方法通過(guò)觀察受試物對(duì)血管的作用評(píng)價(jià)潛在的眼刺激性，具有較高的敏感性[6]。對(duì)于檢測(cè)中度以下的眼刺激性效果較好，尤其是能有效區(qū)分無(wú)刺激性物質(zhì)[7]，但對(duì)輕度刺激性以上的物質(zhì)無(wú)法精確區(qū)分。其不足之處還表現(xiàn)在對(duì)含聚氧乙烯配方的檢測(cè)中容易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果[6]，實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)不溶物質(zhì)的操作要求較高等。該方法適合作為化妝品和個(gè)人護(hù)理用品配方、醇類(lèi)物質(zhì)和表面活性劑的刺激性篩查[2,5]。

BCOP以離體牛眼角膜模擬人角膜進(jìn)行受試物暴露，通過(guò)測(cè)量角膜渾濁度及滲透性的改變?cè)u(píng)價(jià)受試物眼物刺激性[8]。其優(yōu)點(diǎn)在于不受樣品理化性質(zhì)和溶解性的限制，可用于化學(xué)品眼刺激標(biāo)識(shí)和分類(lèi)，還可以延長(zhǎng)角膜培養(yǎng)時(shí)間和增加角膜組織學(xué)檢查以評(píng)估刺激損傷后的恢復(fù)作用和機(jī)制分析。缺點(diǎn)是只評(píng)估了角膜損傷，沒(méi)有考慮受試物對(duì)虹膜和結(jié)膜的刺激作用[9]。BCOP法于2009年被OECD認(rèn)可發(fā)布為試驗(yàn)指南(TG 437)，用于嚴(yán)重刺激性和腐蝕性的鑒別，2013年重復(fù)修訂的版本，確定了其在鑒別無(wú)刺激性中的作用[4]。

本研究結(jié)果表明，采用CAMVA-BCOP的組合方法可明顯提高眼刺激性預(yù)測(cè)的一致性和敏感性，彌補(bǔ)單一方法的不足，達(dá)到替代體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的目的。如果了解產(chǎn)品成分或配方結(jié)構(gòu)，替代方法的組合應(yīng)用特別具有優(yōu)勢(shì)。如何選擇方法組合及其順序應(yīng)綜合考慮評(píng)估目的和樣品特性等因素，例如美國(guó)EPA推薦采用BCOP法、細(xì)胞傳感器法和重建角膜模型(EpiOcular)的組合策略，用于抗菌劑眼刺激性的檢測(cè)[3]。Donahue等人建立了基于化妝品配方優(yōu)化的CAMVA和BCOP的組合方法[10]。日本學(xué)者建立了STE與BCOP方法的組合評(píng)價(jià)化合物的眼刺激性[11]。本研究建立CAMVA-BCOP整合方案適用于個(gè)人護(hù)理用品的測(cè)試，主要考慮到大部分樣品眼刺激性較溫和，而且劑型多樣，配方多變的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)順序采用先CAMVA后BCOP的組合。如果是工業(yè)化學(xué)品，關(guān)注的是化學(xué)物刺激性的準(zhǔn)確標(biāo)識(shí)和分類(lèi)，眼刺激性波動(dòng)范圍可能較大，可在預(yù)判的基礎(chǔ)上，選擇BCOP單一方法測(cè)試或選擇先BCOP后CAMVA的組合[12]。根據(jù)新版的OECD指南，BCOP可以有效鑒別刺激譜兩端的樣品，配合敏感性高的CAMVA，這一組合可解決大部分樣品眼刺激性檢測(cè)的需要，建議的測(cè)試程序如圖1。相信隨著更多標(biāo)準(zhǔn)化的眼刺激替代方法的研發(fā)，以及針對(duì)不同測(cè)試目的建立組合方案的探索和驗(yàn)證，有希望進(jìn)一步提高眼刺激性預(yù)測(cè)的科學(xué)性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 敖華英, 程樹(shù)軍, 談偉君. 不同哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞溶血替代眼刺激實(shí)驗(yàn)的比較 [J]. 中國(guó)組織工程研究, 2012, 16(12):2163-2166.

[2] 程樹(shù)軍, 焦紅. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法原理與應(yīng)用 [M]. 北京: 科學(xué)出版社. 2010:285-304.

[3] EPA BRD-Final Report. Background review document of an in vitro approach for EPA toxicity labeling of anti-microbial cleaning products: EPA toxicity labeling background review document [R]. USA: EPA, 2009.

[4] Bagley DM, Waters D, Kong BM. Development of a 10-day chorioallantoic membrane vascular assay as an alternative to the Draize rabbit eye irritation test [J]. Food Chem Toxicol, 1994, 32(12):1155-1160.

[5] OECD. OECD guideline for testing of chemicals No. 437: Bovine corneal opacity and permeability test method for identifying i) Chemicals inducing serious eye damage and ii) Chemicals not requiring classification for eye irritation or serious eye damage [S]. OECD Paris, 2013, 1-27

[6] Bagley DM, Cerven D, Harbell J. Assessment of the chorioallantoic membrane vascular assay (CAMVA) in the COLIPA in vitro eye irritation validation study [J]. Toxicol In Vitro, 1999, 13(2):285-293.

[7] Daniel MB, Perveen YR, Betty MK, et al. Evaluation of the vascular components of the chorioallantoic membrane assay as a model for eye irritation potential: II [J]. Cutan Ocular Toxicol, 1991, 10(1-2):105-113.

[8] Cameron DM, Donahue DA, Costion GE, et al. Confirmation of in vitro and clinical safety assessment of behentrimonium chloride-containing leave-on body lotions using post-marketing adverse event data[J]. Toxicol In Vitro, 2013,27(8):2203-2212.

[9] ICCVAM. Test Method Evaluation Repor: In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM)[R]. NIH Publication : 2007.

[10] Donahue DA, Kaufman LE, Avalos J, et al. Survey of ocular irritation predictive capacity using chorioallantoic membrane vascular assay (CAMVA) and bovine corneal opacity and permeability (BCOP) test historical data for 319 personal care products over fourteen years [J]. Toxicol In Vitro, 2011, 25(2):563-572.

[11] Hayashi K, Mori T, Abo T, et al. A tiered approach combining the short time exposure (STE) test and the bovine corneal opacity and permeability (BCOP) assay for predicting eye irritation potential of chemicals[J] Toxicol Sci. 2012, 37(2):269-280.

[12] 敖華英,程樹(shù)軍,潘芳,等.化妝品眼刺激試驗(yàn)替代方法標(biāo)準(zhǔn)化與展望[J],中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(1):79-83.