徐春艷, 趙林雙
(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院內(nèi)分泌科,湖北 武漢 430070)
血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody,AT1-AA)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,是針對AT1受體(AT1receptor,AT1R)的特異性抗體,具有類似血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)的生物學效應。自AT1-AA首次在先兆子癇患者體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[1]以來,又先后證實其與難治性高血壓患者蛋白尿發(fā)生率有關(guān)[2],并參與了原發(fā)性腎小球疾病過程[3],成為獨立于高血壓之外的致腎臟損害的因素。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)患者血清AT1-AA陽性率明顯高于糖尿病患者和正常對照者[4],提示AT1-AA與DN發(fā)病過程有關(guān),但其致DN腎臟損害的具體機制尚不清楚。
研究顯示,DN時腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)的活化可引起腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS),并可通過JNK凋亡途徑誘導腎臟細胞凋亡[5-6]。AT1R是RAS的關(guān)鍵因子,也是AT1-AA發(fā)揮效應的特異性受體,但其能否介導AT1-AA而致DN腎臟ERS反應,目前未見報道。因此,我們通過本研究探討DN大鼠血清AT1-AA與腎臟ERS及其相關(guān)的JNK凋亡信號通路的關(guān)系,以進一步了解AT1-AA致DN腎臟細胞凋亡的分子機制。
36只4周齡雄性SD大鼠,購自武漢大學動物實驗中心,實驗動物合格證編號為42000500001559。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫20~24 ℃,相對濕度40%~60%,自由攝食飲水,12 h交替照明。
鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(Sigma);TUNEL試劑盒(Promega);BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)抗體(Bioworld);磷酸化c-Jun N末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)抗體(Santa Cruz);β-actin抗體、羊抗小鼠Ⅱ抗、羊抗兔Ⅱ抗和兔抗小鼠Ⅱ抗(武漢博士德生物工程有限公司)。全自動生化儀(BECKMAN COULTER UniCelDxC 800);HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗科提供)。
3.1模型大鼠的建立 所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機選取6只為正常對照(NC),選取30只進行造模處理。NC組大鼠以普通飼料食喂養(yǎng),造模大鼠以高糖高脂飼料喂養(yǎng)。造模大鼠于高糖高脂喂養(yǎng)4周時腹腔注射1%的STZ溶液(35 mg/kg),NC組注射等量的檸檬酸緩沖液。72 h后測尾靜脈血糖,隨機血糖>16.7 mmol/L認為糖尿病大鼠模型建立成功,繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng),每周復測血糖,持續(xù)觀察12周至其自然進展至DN階段[7]。 將模型建立成功大鼠統(tǒng)一歸為模型組(model組)。
3.2血清AT1-AA的測定及分組 大鼠稱重,給予10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔麻醉,腔靜脈取血,收集血清,分裝后-20 ℃保存。AT1R抗原肽片段的氨基酸序列為5’-IHRNVFFIENTTNITVCAFHYESQNSTL-3'(由華中科技大學附屬協(xié)和醫(yī)院心血管研究室人工合成并饋贈)。ELISA法測定血清AT1-AA 的A值[8],根據(jù)AT1-AA測定結(jié)果,隨機選擇DN大鼠納入DN組,并分AT1-AA陽性DN(AT1-AA positive DN,APD)和AT1-AA陰性DN(AT1-AA negative DN,AND)亞組。
3.3血、尿生化指標的檢測 實驗結(jié)束前1 d,用代謝籠收集大鼠24 h尿液并記錄尿量,4 ℃保存。應用全自動生化儀檢測尿肌酐(urine creatinine,UCr)和尿微量白表達(urine microalbumin,UMA);同時檢測血糖(blood glucose,BG)、血肌酐(serum creatinine,SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN),計算肌酐清除率(creatinine clearance rate,CCr)。
3.4TUNEL染色測定腎臟細胞凋亡 制備腎組織石蠟切片,常規(guī)脫水,嚴格按試劑盒說明進行TUNEL染色,DAB顯色。光鏡下觀察,凋亡細胞呈棕褐色。應用MIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)計數(shù)凋亡細胞,計算凋亡率。
3.5Western blotting技術(shù)測定腎組織GRP78和p-JNK蛋白表達 提取大鼠腎組織總蛋白,BCA法測定總蛋白濃度。10%的SDS-PAGE分離蛋白,PVDF膜印跡,5%脫脂奶粉封閉,GRP78抗體(1∶600)、p-JNK抗體(1∶3 000)或β-actin抗體(1∶400)浸泡,4 ℃過夜,分別加入辣根過氧化物酶HRP標記的Ⅱ抗(1∶50 000)孵育2 h,滴加ECL底物液,暗視中X光片壓片、顯影、定影,應用凝膠成像系統(tǒng)分析膠片灰度值比值,進行蛋白的定量分析。
數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行分析。計數(shù)資料以構(gòu)成比表示,采用2檢驗;計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
實驗結(jié)束時,造模大鼠5只死亡,1只未成模,成模率為96.7%,死亡率為16.7%。與NC組大鼠比較,model組大鼠體重明顯減輕,而血糖及腎臟肥大指數(shù)均明顯升高,見表1。
表1 NC組和model組大鼠血糖、體重和腎肥大指數(shù)的比較
Model組大鼠血清AT1-AA陽性率為62.5%,較NC組16.7%明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。根據(jù)AT1-AA結(jié)果,在24只Model組大鼠中隨機選取8只AT1-AA陽性和4只AT1-AA陰性大鼠納入DN組,其中AT1-AA陽性DN為APD亞組,AT1-AA陰性DN為AND亞組。
與NC組比較,APD亞組大鼠的BUN和24 h UMA水平明顯升高(均P<0.01),CCr顯著降低(P<0.05);與APD亞組大鼠比較,前述各生化指標在AND亞組大鼠中變化程度相對較輕,見表2。
表2 各亞組大鼠腎功能生化指標結(jié)果比較
DN組大鼠腎臟細胞凋亡率(16.65±5.01)較NC組大鼠(0.38±0.24)顯著增高(P<0.01),其中腎小管上皮細胞和腎小球足細胞均有凋亡,但以腎小管上皮細胞凋亡為主。進一步觀察發(fā)現(xiàn),APD亞組大鼠腎臟細胞凋亡率(20.05±1.71)明顯高于AND亞組(13.24±4.93)(P<0.01),見圖1。
Figure 1. Apoptosis of renal cells in all groups under optical microscope by TUNEL staining assay (×400). Apoptotic cells were brown as indicated by the arrows. Mean±SD. n=4~12. ** P<0.01 vs NC group; ##P<0.01 vs AND sub-group.
Western blotting結(jié)果顯示,DN組大鼠腎組織GRP78和p-JNK的表達分別為0.750±0.030和0.603±0.048,而NC組大鼠為0.334±0.001和0.209±0.003,2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖2。
Figure 2. The protein levels of GRP78 and p-JNK in DN group and NC group. Mean±SD. n=6~12.**P<0.01 vs NC group.
進一步研究發(fā)現(xiàn),APD亞組GRP78的表達(0.774±0.026)較AND亞組(0.728±0.003)明顯升高(P<0.05);且APD亞組p-JNK的表達(0.643±0.026)亦高于AND亞組(0.562±0.018)(P<0.01),見圖3。
Figure 3. The protein levels of GRP78 and p-JNK in APD and AND sub-groups. Mean±SD. n=4~8. #P<0.05, ##P<0.01 vs AND sub-group.
DN是糖尿病危險而嚴重的微血管并發(fā)癥,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢,已成為人類健康的重要威脅。但因DN是多因素綜合作用的結(jié)果,發(fā)病機制十分復雜,至今仍未完全明確。本課題組前期大量臨床研究發(fā)現(xiàn),G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體相關(guān)的自身免疫反應參與了DN的發(fā)病過程,并與DN患者蛋白尿水平關(guān)系密切[9],因而認為自身免疫機制在DN病程中也起了重要作用。其中,AT1-AA通過與RAS的關(guān)鍵因子AT1R胞外第二環(huán)肽上的氨基酸序列特異性結(jié)合而發(fā)揮AngⅡ樣激動效應,且該激動效應不隨時間而脫敏。目前普遍認為,各種組織損傷和生理紊亂所致隱蔽抗原暴露,機體自身免疫應答反應激活,均可使機體AT1-AA產(chǎn)生增多[10]。而在DN狀態(tài)下,高糖毒性和RAS活化等因素可能通過循環(huán)或局部組織AngⅡ濃度升高或胞內(nèi)信號通路變化而致AT1R的構(gòu)象和密度改變,進而引起血清AT1-AA生成增多,但AT1-AA與DN腎臟結(jié)構(gòu)損害的關(guān)系及作用機制,目前未見報道。
腎臟細胞凋亡在DN腎功能惡化過程中起重要作用,是DN腎損害的重要機制。本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射,然后繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng),任糖尿病大鼠自然進展為DN階段而得到的DN模型,是目前公認的接近人類2型DN自然病程和代謝特點的大鼠模型。實驗中,TUNEL染色檢測DN大鼠腎臟細胞凋亡并定位發(fā)現(xiàn),AT1-AA陽性DN大鼠腎臟細胞凋亡率明顯高于AT1-AA陰性DN大鼠,表明AT1-AA在DN大鼠腎臟細胞凋亡過程中起到一定作用。大量腎臟細胞凋亡可直接導致尿蛋白水平顯著增加,腎功能明顯降低,這是本研究中AT1-AA陽性和陰性DN大鼠腎功能生化指標差異顯著的原因,但AT1-AA致腎臟細胞凋亡的具體分子機制還需進一步探索。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、加工和Ca2+儲存及信號轉(zhuǎn)導的重要場所,可通過ERS對各種因素所致的應激反應起調(diào)節(jié)作用[11]。早期ERS能激活未折疊蛋白反應,減少蛋白質(zhì)合成,增加蛋白質(zhì)折/疊降解來維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,在該反應過程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶GRP78起著主要的調(diào)控作用而成為ERS的標志性蛋白[12]。然而過度ERS會通過其相關(guān)的3條凋亡途徑:CHOP/GADD153基因激活轉(zhuǎn)錄,JNK磷酸化和caspase-12活化,促進應激受損細胞的凋亡[13]。其中,JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族的重要成員,可在各種應激刺激(如高糖,氧化應激,G蛋白偶聯(lián)受體激活等)作用下磷酸化而活化。p-JNK主要通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的活性,上調(diào)促凋亡蛋白Bim、Bax等的表達引起細胞凋亡[14]。
研究發(fā)現(xiàn),DN大鼠腎臟ERS反應與腎小管細胞的凋亡有關(guān)[15],且高糖可激活足細胞內(nèi)ERS相關(guān)的多條凋亡途徑,引起足細胞的損傷和凋亡[16],均表明過度ERS在DN腎臟細胞凋亡過程中起著重要作用。研究證實,AngⅡ能上調(diào)心肌細胞GRP78的表達,并介導心肌細胞的凋亡,而AT1R特異性拮抗劑可降低DN大鼠腎組織GRP78及p-JNK蛋白的表達,抑制JNK途徑介導的腎臟細胞凋亡[6]。已知AT1-AA與AngⅡ均可通過AT1R而激活下游信號分子,并能經(jīng)相似的信號通路發(fā)揮效應,故假設(shè)DN發(fā)電時,血清中持續(xù)存在的高滴度AT1-AA通過AT1R激活腎臟ERS反應,并活化JNK凋亡信號通路,使p-JNK凋亡蛋白的水平增高,促進腎臟細胞凋亡。但關(guān)于血清AT1-AA與腎臟ERS反應的研究,目前尚少。
本實驗中,我們利用Western blotting技術(shù)對DN組和NC組大鼠腎臟GRP78和p-JNK蛋白進行定量分析。結(jié)果顯示,DN組大鼠前述蛋白水平較NC組大鼠顯著升高,提示DN組大鼠腎臟發(fā)生了ERS反應,并激活了ERS相關(guān)的凋亡信號通路,與國內(nèi)外的報道一致。為明確AT1-AA對DN大鼠腎臟ERS的影響,我們進一步研究了AT1-AA陽性和陰性亞組DN大鼠的Western blotting結(jié)果,發(fā)現(xiàn)AT1-AA陽性DN大鼠ERS標志蛋白GRP78和凋亡蛋白p-JNK的表達均不同程度高于AT1-AA陰性DN大鼠。據(jù)此我們認為,DN大鼠血清AT1-AA與腎臟ERS關(guān)系密切,AT1-AA可調(diào)控ERS標志蛋白GRP78的轉(zhuǎn)錄,且持續(xù)存在的AT1-AA的病理性刺激,又能激活ERS相關(guān)的JNK凋亡通路;與AT1-AA陰性DN大鼠比較,AT1-AA陽性大鼠腎組織p-JNK蛋白表達上調(diào),腎臟細胞凋亡增加,也說明AT1-AA能通過ERS的JNK凋亡途徑促進腎臟細胞凋亡,證實了我們的假設(shè)。
綜上所述,血清AT1-AA的腎臟損害作用與其所致的腎臟細胞凋亡有關(guān);AT1-AA可誘導DN大鼠腎臟ERS反應,并上調(diào)p-JNK凋亡蛋白的表達,通過JNK通路促進腎臟細胞凋亡。這些研究結(jié)果可為進一步完善DN的免疫機制及通過干擾ERS中的自身免疫環(huán)節(jié)來防治DN提供全新的理論支持。
[參 考 文 獻]
[1] Wallukat G, Homuth V, Fischer T, et al. Patients with preeclampsia develop agonistic antibodies against the angiotensin AT1receptor[J]. J Clin Invest, 1999, 103(7): 945-952.
[2] Fu ML, Herlitz H, Schulze W, et al. Autoantibodies against the angiotensin receptor (AT1) in patients with hypertension[J]. J Hypertens, 2000, 18(7): 945-953.
[3] 熊 京, 楊慧敏, 朱 峰, 等. 血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體在原發(fā)性腎小球疾病患者血清中的表達及意義[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(8):1487-1491.
[4] 趙林雙, 向光大, 樂 嶺, 等. 糖尿病腎病患者血清抗AT1和α1受體抗體與腎小球濾過率的關(guān)系[J]. 華南國防醫(yī)學雜志, 2012, 26(5):448-451.
[5] Arora MK, Singh UK. Molecular mechanisms in the pathogenesis of diabetic nephropathy: an update[J]. Vascul Pharmacol, 2013, 58(4):259-271.
[6] Lakshmanan AP, Thandavarayan RA, Palaniyandi SS, et al. Modulation of AT-1R/CHOP-JNK-Caspase12 pathway by olmesartan treatment attenuates ER stress-induced renal apoptosis in streptozotocin-induced diabetic mice[J]. Eur J Pharm Sci, 2011, 44(5):627-634.
[7] 楊 峰, 唐麗琴, 王風玲, 等.大鼠糖尿病腎病模型建立影響因素研究[J]. 安徽醫(yī)藥, 2012, 16(6):735-738.
[8] Liao YH, Wei YM, Wang M. Autoantibodies against AT1-receptor and α1-adrenergic receptor in patients with hypertension[J]. Hypertens Res, 2002, 25(4):641-646.
[9] 趙林雙, 孫慧伶,向光大, 等. 美托洛爾聯(lián)合貝那普利對β1、AT1受體自身抗體陽性的糖尿病腎病患者尿白蛋白的影響[J]. 中國糖尿病雜志, 2011,19(4): 260-262.
[10] Wang B, Liao YH, Zhou ZH, et al. Arterial structural changes in rats immunized by AT1-receptor peptide[J]. Heart Vessels, 2005, 20(4):153-158.
[11] 姚樹桐,秦樹存. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展和防治中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(2):364-368,384.
[12] Kim R, Emi M, Tanabe K, et al. Role of the unfolded protein response in cell death[J]. Apoptosis, 2006,11(1):5-13.
[13] Fribley A, Zhang K, Kaufman RJ. Regulation of apoptosis by the unfolded protein response[J]. Methods Mol Biol, 2009, 559:191-204.
[14] Okuno S, Saito A, Hayashi T, et al. The c-Jun N-terminal protein kinase signaling pathway mediates Bax activation and subsequent neuronal apoptosis through interaction with Bim after transient focal cerebral ischemia[J]. J Neurosci, 2004, 24(36):7879-7887.
[15] Sun HL, Sun L, Li YY, et al. ACE-inhibitor suppresses the apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress in renal tubular in experimental diabetic rats[J]. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2009, 117(7):336-344.
[16] Cao Y, Hao Y, Li H, et al. Role of endoplasmic reticulum stress in apoptosis of differentiated mouse podocytes induced by high glucose[J]. Int J Mol Med, 2014, 33(4):809-816.