靳有鵬， 龐婷婷， 王 偉， 王玉林

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院兒科， 山東 濟(jì)南 250021)

慢性低氧性肺動脈高壓是臨床許多心肺疾病發(fā)生發(fā)展過程中伴隨或最終的病理生理環(huán)節(jié)，是一種嚴(yán)重的甚至危及生命的肺血管性疾病，臨床上表現(xiàn)為肺動脈壓力增高、肺血管阻力增加，右心室阻力負(fù)荷過重最終致右心衰竭，組織病理學(xué)改變?yōu)槔奂叭珜拥难苎?，管壁的所有成分?xì)胞均受累，最終肺血管及右室重塑。

微小RNA(microRNA，miRNA)是廣泛存在于真核生物中的一類長度為20～24個(gè)核苷酸所構(gòu)成的內(nèi)源性非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，它是由含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體經(jīng)Dicer剪切而成。越來越多的研究證實(shí)，miRNA作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因，通過抑制靶信使mRNA 的翻譯而起到重要的調(diào)控作用，參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡以及多種生物組織的發(fā)育調(diào)節(jié)過程[1]。研究表明哺乳動物中50%～60%的mRNA受miRNA調(diào)控[2]。

近年來的研究表明，miRNA在低氧下細(xì)胞進(jìn)行生理性及病理性調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。其中一些miRNA的表達(dá)顯著地受低氧調(diào)節(jié)，因此被命名為“低氧相關(guān)的微小RNA(hypoxia-related miRNA)”[3]。MicroRNA-210(miR-210)是一種在低氧下表達(dá)顯著上調(diào)的miRNA，它參與調(diào)節(jié)血管生成、細(xì)胞凋亡、增殖、分化、DNA修復(fù)、線粒體代謝以及腫瘤生長[4-7]，其在肺動脈高壓中的作用日益受到重視，有研究發(fā)現(xiàn)在慢性低氧所致肺動脈高壓鼠的肺組織中miR-210表達(dá)上調(diào)[8]， 但其在低氧性肺動脈高壓中的作用仍不甚清楚。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑廣泛存在。真核細(xì)胞中是由4種激酶組成的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中，每種激酶都通過復(fù)雜的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)激活下游底物激酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化或凋亡，被廣泛用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究。它的級聯(lián)反應(yīng)實(shí)際上是分3步進(jìn)行的：首先是MAPKK激酶(MAPKK kinase，MKKK)磷酸化激活MAPK激酶(MAPK kinase，MKK)，后者活化后磷酸化激活MAPK，活化的MAPK再去激活一些轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因表達(dá)?；罨腗APK主要被其磷酸酶去磷酸化而失活，這其中絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP-1)的作用最為重要。研究發(fā)現(xiàn)， MKP-1可被低氧誘導(dǎo)[9]，近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其在肺動脈高壓中起著重要作用。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MKP-1缺失的小鼠易發(fā)展為重度肺動脈高壓[10]，也有研究證實(shí)西地那非通過誘導(dǎo)MKP-1在肺動脈平滑肌細(xì)胞中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[11]。但關(guān)于miR-210通過調(diào)節(jié)MKP-1而參與肺動脈高壓的相關(guān)研究，至今尚未見報(bào)道。

本文旨在研究低氧時(shí)人肺動脈平滑肌細(xì)胞(human pulmonary artery smooth muscle cells, hPASMCs)miR-210和MKP-1的表達(dá)情況、它們之間的相互關(guān)系以及對肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響，為治療低氧性肺動脈高壓提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

人肺動脈平滑肌細(xì)胞購于Lonza；RNA提取試劑Trizol和轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、引物、miRNA抑制劑及增強(qiáng)劑均購自生命技術(shù)公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

將hPASMCs置于含4.9% FBS及多種生長因子的培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至80%～90%融合時(shí)進(jìn)行傳代或用于實(shí)驗(yàn)分組接種，取4～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)前取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)含0.02% EDTA/0.25%胰蛋白酶消化液消化，形成細(xì)胞懸液后分組接種，細(xì)胞于貼壁24 h后，換無血清培養(yǎng)基24 h使細(xì)胞生長同步化，再分別處理各實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)分組:共分成12組，常氧處理(21% O2、5% CO2)6組和低氧處理(1% O2、5%CO2)6組，見表1。

3 主要方法

3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組平滑肌細(xì)胞中miR-210和MKP-1 mRNA的表達(dá) RNA提取試劑和轉(zhuǎn)染試劑均購自Invitrogen。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA并測定其濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再按說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以RNU48作為小RNA含量的內(nèi)參照。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min熱啟動，然后94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。最后通過解鏈曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。 miRNA的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt方法來表示。

3.2用Western blotting法比較各組MKP-1蛋白的表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，取20 μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，按濕轉(zhuǎn)法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉2 h，滴加Ⅰ抗(1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗膜，滴加Ⅱ抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜后顯色，并用β-actin作為內(nèi)參照。

3.3MTT法檢測肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖 培養(yǎng)細(xì)胞中加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)37 ℃孵育4 h后，吸棄培養(yǎng)上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min。在ELISA檢測儀上測定各孔的A490值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 (mean±SEM) 來表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

結(jié) 果

1 低氧時(shí)hPASMCs miR-210的表達(dá)

hPASMCs分別放置于21% O2或1% O2的培養(yǎng)箱中48 h后，發(fā)現(xiàn)miR-210的表達(dá)水平明顯增加，見圖1。

Figure 1. The expression of miR-210 in the hPASMCs determined by quantitative real-time PCR analysis.The hPASMCs were exposed to 21% O2 (normoxia) or 1% O2 (hypoxia) for 48 h. miR-210 mRNA levels were normalized to RNU48 expression.Mean±SEM.n=3. **P<0.01 vs 21% O2.

2 低氧時(shí)hPASMCs MKP-1的表達(dá)

hPASMCs分別放置于21% O2或1% O2的培養(yǎng)箱中48 h后，發(fā)現(xiàn)MKP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加，見圖2。

Figure 2. Expression of MKP-1 mRNA (A) and protein (B) in the hPASMCs. The hPASMCs were exposed to 21% O2 (normoxia) or 1% O2 (hypoxia) for 48 h.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs 21% O2.

3 抑制miR-210表達(dá)使MKP-1的表達(dá)增加并可抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖

將miR-210抑制劑轉(zhuǎn)染入hPASMCs內(nèi)，再分別放置于21% O2或1% O2的培養(yǎng)箱中48 h后，發(fā)現(xiàn)常氧及低氧下，miR-210抑制劑明顯抑制miR-210的表達(dá)，增加MKP-1的表達(dá)，但只有低氧下抑制miR-210的表達(dá)后hPASMCs的增殖受到抑制，常氧下卻沒有這種效應(yīng)，見圖3。

4 miR-210過表達(dá)可抑制低氧誘導(dǎo)的MKP-1表達(dá)上調(diào)但不影響細(xì)胞增殖

將miR-210增強(qiáng)劑轉(zhuǎn)染入hPASMCs內(nèi)，再分別放置于21% O2或1% O2的培養(yǎng)箱中48 h后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-210過表達(dá)明顯抑制低氧誘導(dǎo)的MKP-1表達(dá)上調(diào)，但常氧及低氧均未影響hPASMCs的增殖，見表2、圖4。

5 MKP-1基因沉默后，低氧下miR-210抑制劑對細(xì)胞增殖的抑制作用消失

再將miR-210抑制劑轉(zhuǎn)染入hPASMCs內(nèi)，再分別放置于1% O2培養(yǎng)箱中48 h后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MKP-1基因沉默后，低氧下miR-210抑制劑對細(xì)胞增殖的抑制作用消失，見圖5。

討 論

2007年首次報(bào)道了通過微距陣的方法發(fā)現(xiàn)了低氧下miR-210的表達(dá)會上調(diào)，該作用可被低氧誘導(dǎo)因子 1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)或低氧誘導(dǎo)因子 2α(hypoxia-inducible factor 2α，HIF-2α)所誘導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)將hPASMCs置于低氧培養(yǎng)箱中48 h，miR-210的表達(dá)升高2.5倍左右，說明hPASMCs中miR-210的表達(dá)可被低氧所誘導(dǎo)。有研究發(fā)現(xiàn)，在急性缺氧的情況下，低氧誘導(dǎo)的miR-210通過下調(diào)鐵硫蛋白1/2[12]或線粒體電子傳遞蛋白[13-14]的表達(dá)來保障細(xì)胞存活，然而，另一方面這又是引起慢性缺氧性疾病的病理生理基礎(chǔ)。

MKP-1屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，是細(xì)胞內(nèi)的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MKP-1的表達(dá)在多種因素刺激下均會增加，包括低氧、過氧化、糖皮質(zhì)激素升高、熱休克等。本研究同樣發(fā)現(xiàn)低氧下的hPASMCs中MKP-1的表達(dá)增加。在多種細(xì)胞生理反應(yīng)(如生長因子信號調(diào)節(jié)通路、細(xì)胞的炎癥、分化及凋亡等)中，MKP-1都通過使絲裂原活化蛋白激酶去磷酸化而提供重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。類似miR-210，在低氧狀態(tài)下MKP-1也發(fā)揮著很多作用。研究表明MKP-1基因敲除的小鼠易表現(xiàn)為過度的炎癥反應(yīng)，易患自身免疫性疾病及代謝缺陷病[15-16]。

Figure 3. The effects of miR-210 inhibitor on hypoxia-induced MKP-1 expression and proliferation in the hPASMCs. The hPASMCs were exposed to 21% O2 (normoxia) or 1% O2 (hypoxia) for 48 h. A: miR-210 expression; B,C: MKP-1 mRNA and protein expression; D: proliferation of hPASMCs. Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs negative control;□P<0.05,□□P<0.01 vs 21% O2；△P<0.05,△△P<0.01 vs 1% O2+negative control.

表2 miR-210增強(qiáng)劑對miR-210表達(dá)的影響

Figure 4. The effects of miR-210 mimic on MKP-1 expression (A,B) and proliferation (C) in the hPASMCs.The hPASMCs were exposed to 21%O2 (normoxia) or 1%O2 (hypoxia)for 48 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs negative control;□□P<0.01 vs 21% O2; △△P<0.01 vs 21% O2 negative control.

Figure 5. The effects of MKP-1 knockdown (A,B) on miR-210 inhibitor-decreased hPASMC proliferation (C) under hypoxia.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs negative control； △△P<0.01 vs miR-210 inhibitor.

另有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MKP-1缺失的小鼠在低氧下易患更嚴(yán)重的肺動脈高壓，提示MKP-1在低氧性肺高壓中發(fā)揮著重要作用[10]。

雖然miR-210和MKP-1在低氧性肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展中均起著舉足輕重的作用，但它們之間的相互關(guān)系仍不甚清楚。本研究結(jié)果顯示不論是低氧下或常氧下的hPASMCs中，抑制miR-210的表達(dá)后，MKP-1轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)均增加，而增加miR-210的表達(dá)后，MKP-1轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)均下降。由此說明，hPASMCs的MKP-1是miR-210的靶基因。通常MKP-1通過MAPK起作用，且MKP-1的作用取決于其與MKK的相對活性，關(guān)于miR-210與MKK的關(guān)系尚未見報(bào)道，miR-210是否進(jìn)一步通過調(diào)節(jié)MKK的活性來調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究來證實(shí)。

本研究還發(fā)現(xiàn)在hPASMCs中，抑制miR-210的表達(dá)可以減少低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但miR-210的過表達(dá)卻并不影響細(xì)胞的增殖情況，由此說明，低氧下miR-210可負(fù)性調(diào)節(jié)hPASMCs的增殖，然而，近年來有另外一項(xiàng)研究報(bào)道[17]，miR-210在hPASMCs中發(fā)揮抗凋亡的作用而并不影響細(xì)胞的增殖，這似與本研究結(jié)果有所不同，究其原因可能有如下兩方面。一是，這2個(gè)實(shí)驗(yàn)所采用的培養(yǎng)細(xì)胞的氧濃度不同，本研究采用的氧濃度為1%，而另一研究采用的氧濃度為3%。二是，另有其它研究發(fā)現(xiàn)miRNA對靶基因呈非線性、劑量依賴性的選擇性調(diào)節(jié)作用[18]，本研究中miR-210抑制劑的量與另一研究中所采用的劑量也不同，這可能也是原因之一。而且，miR-210抑制劑對細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)作用需依靠MKP-1來發(fā)揮，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在低氧下的hPASMCs中，MKP-1是miR-210的一個(gè)新的靶基因，MKP-1可以介導(dǎo)miR-210抑制劑對hPASMCs增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，這有望成為治療低氧性動脈肺高壓的新的靶點(diǎn)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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