李春雨， 蘇瑋蓮， 魏曉露， 李國霞

(天津醫(yī)科大學(xué)國際醫(yī)學(xué)院，天津 300070)

腎小管間質(zhì)損害是腎小球腎炎由炎癥啟動(dòng)進(jìn)展至腎小球硬化的中間環(huán)節(jié)，腎小球腎炎進(jìn)展至腎小球硬化，大多已不可逆轉(zhuǎn)，而對其中間環(huán)節(jié)即腎小管間質(zhì)損害進(jìn)行早期有效干預(yù)則可大大延緩腎小球腎炎進(jìn)展，對防治慢性腎臟疾病具有重要意義[1-2]。扶腎降濁方在臨床廣泛用于慢性腎臟疾病的治療，多年的臨床實(shí)踐表明，總有效率達(dá)82.5%[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，扶腎降濁方能改善慢性腎功能衰竭大鼠的常規(guī)生化指標(biāo)，延緩腎衰的病理進(jìn)程[4]。但對腎小管間質(zhì)損害的保護(hù)作用機(jī)制尚不十分清楚。本文采用血清藥理學(xué)的研究方法，基于轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)角度，探討扶腎降濁方對系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN)腎小管間質(zhì)損害的保護(hù)作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 藥物與試劑

扶腎降濁方組成：山茱萸12 g，生黃芪30 g，白花蛇舌草30 g，丹參30 g，鬼箭羽30 g，益母草30 g，實(shí)驗(yàn)所用中藥制劑為天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院按既定工藝制備的配方顆粒，每克含生藥4.06 g，批號：20120810；葡萄球菌腸毒素B由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供；完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑為Sigma產(chǎn)品；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)為Amresco產(chǎn)品；Trizol reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自天根生化科技有限公司；全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、Western blotting檢測試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

2 動(dòng)物

雄性Wistar大鼠20只，體重(150±10)g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所提供，合格證號為SCXK(軍)2009-003。

3 儀器

Leica DMI 4000B倒置熒光顯微鏡(德國徠卡公司)；電泳儀(大連競邁生物科技有限公司)；DH-2000凝膠圖像采集分析系統(tǒng)(Heraeus)；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

4 方法

4.1含藥血清制備 6只Wistar大鼠隨機(jī)分為：扶腎降濁方組(3只)和空白對照組(3只)。扶腎降濁方組以生藥51.5 g/kg劑量(成人劑量的15倍)灌胃給藥，每日2次，空白對照組給予等體積生理鹽水。連續(xù)3 d，于末次給藥后1 h腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min，3 000 r/min 離心20 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，0.22 μm濾膜除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.2病理狀態(tài)間質(zhì)成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)制MsPGN大鼠動(dòng)物模型[5-6]：6只Wistar大鼠隨機(jī)分為：模型組(3只)和空白對照組(3只)，自實(shí)驗(yàn)第1天起，模型組大鼠以BSA水溶液配成隔日灌胃1次，空白對照組大鼠給予等體積生理鹽水隔日灌胃1次，共12至20周。實(shí)驗(yàn)的第1天模型組分點(diǎn)注射完全弗氏佐劑0.2 mL(含BSA 2 mg),第8天注射不完全弗氏佐劑0.2 mL(含BSA 2 mg)，實(shí)驗(yàn)的第8、15天尾靜脈注射金黃色葡萄球菌腸毒素B(0.4 mg/kg,配成水溶液)各1次?？瞻讓φ战M注射等體積生理鹽水。經(jīng)病理組織學(xué)(Masson染色)證實(shí)本實(shí)驗(yàn)MsPGN大鼠動(dòng)物模型復(fù)制成功。取第12、16和20周的模型大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)培養(yǎng)正常大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞作為空白對照。無菌條件下，將富含小管間質(zhì)的腎組織剪碎成1 mm×1 mm×1 mm小塊，經(jīng)PBS洗滌，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×109/L后接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)皿中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞以密度1.2×109/L接種于6孔培養(yǎng)板，分為5組：空白對照組(正常間質(zhì)成纖維細(xì)胞)、模型對照組和含藥血清低、中、高劑量組(分別為5%、10%和20%扶腎降濁方含藥血清)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h，加入含藥血清(空白對照和模型對照組加入20%對照血清)作用48 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

4.3Real-time PCR Trizol法提取總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，引物序列見表1，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL：2×Super Real PreMix Plus 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，模板(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s；50～60 ℃退火/延伸30 s；循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)生成熔解曲線，結(jié)果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt法對目的基因進(jìn)行相對定量分析[7-9]。

表1 引物序列

4.4Western blotting 蛋白變性后在10% SDS-PAGE中分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Ⅰ抗4 ℃搖床振蕩孵育過夜，第2天回收Ⅰ抗，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入Ⅱ抗，室溫?fù)u床振蕩孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，Gel-Pro 3.2軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用單因素方差分析法進(jìn)行組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 扶腎降濁方含藥血清對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smads信號通路mRNA表達(dá)的影響

MsPGN大鼠腎小管間質(zhì)損害后體外培養(yǎng)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，模型組與對照組比較，TGF-β1和Smad3 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，Smad7 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。隨著造模周期的延長，5%扶腎降濁方含藥血清在第20周以及10%含藥血清在第16和20周以及20%含藥血清在第12、16和20周均可明顯下調(diào)成纖維細(xì)胞TGF-β1和Smad3 mRNA表達(dá)(P<0.05)，上調(diào)Smad7 mRNA表達(dá)(P<0.05)，但無明顯的時(shí)間依賴性，見表2～4。

表2 扶腎降濁方含藥血清對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響

表3 扶腎降濁方含藥血清對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞Smad3 mRNA表達(dá)的影響

表4 扶腎降濁方含藥血清對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞Smad7 mRNA表達(dá)的影響

2 扶腎降濁方含藥血清對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smads信號通路蛋白表達(dá)的影響

MsPGN大鼠腎小管間質(zhì)損害后體外培養(yǎng)間質(zhì)成纖維細(xì)胞，模型組與對照組比較，TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，Smad7蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。5%、10%和20%扶腎降濁方含藥血清在第12、16和20周能明顯下調(diào)成纖維細(xì)胞TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)(P<0.05)，上調(diào)Smad7蛋白表達(dá)(P<0.05)，但無明顯的時(shí)間依賴性，結(jié)果見圖1～3。

Figure 1. Expression of proteins in renal interstitial fibroblasts in 12 weeks detected by Western blotting.1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3.△P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs model group.

討 論

TGF-β1是腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因素，TGF-β1可直接促進(jìn)腎小管細(xì)胞和間質(zhì)纖維細(xì)胞合成膠原、纖維連接蛋白和層黏連蛋白；介導(dǎo)腎素血管緊張素、血小板生長因子、結(jié)締組織生長因子的致纖維化作用。急慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病、腎移植排斥反應(yīng)、多囊腎和間質(zhì)性腎炎等纖維化進(jìn)程均與TGF-β1的高表達(dá)有關(guān)。因此，有效地切斷TGF-β1的信號通路，是中止或減輕腎纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。Smads蛋白是TGF-β家族信號從受體到核的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，TGF-β1通過其Ⅰ型和Ⅱ型受體完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以激活其下游Smads信號分子的磷酸化，隨后引起核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。Smads家族中Smad2～4、Smad6和Smad7參與TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。Smad3是目前所知唯一TGF-β1受體的胞內(nèi)激酶底物，介導(dǎo)了TGF-β1的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad7是具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)TGF-β1功能的細(xì)胞分泌因子，是TGF-β1特有的內(nèi)源性抑制因子，其表達(dá)的調(diào)控是阻斷腎小球TGF-β1效應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12-13]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，扶腎降濁方干預(yù)腎小管間質(zhì)損害造成的腎組織TGF-β1/Smads/ILK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因和蛋白表達(dá)異常，負(fù)性調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，減少炎細(xì)胞的浸潤與減輕腎小管間質(zhì)和腎小球損傷，延緩腎小管間質(zhì)損害病程的進(jìn)展。本研究探討了扶腎降濁方含藥血清對病理狀態(tài)間質(zhì)成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路mRNA和蛋白表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)角度闡明該方對腎小管間質(zhì)損害的保護(hù)作用機(jī)制。

Figure 2. Expression of proteins in renal interstitial fibroblasts in 16 weeks detected by Western blotting.1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs model group.

本研究發(fā)現(xiàn)，MsPGN大鼠發(fā)展為腎小管間質(zhì)損害后，體外培養(yǎng)病理狀態(tài)間質(zhì)成纖維細(xì)胞，TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生改變，其中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，Smad7 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)。隨著造模周期的延長，扶腎降濁方含藥血清能部分逆轉(zhuǎn)腎小管損害造成的上述mRNA和蛋白表達(dá)的異常，提示扶腎降濁方含藥血清可通過抑制TGF-β1和Smad3 mRNA和蛋白的過度表達(dá)，增加Smad7 mRNA和蛋白表達(dá)，可能是其發(fā)揮保護(hù)腎小管間質(zhì)作用的機(jī)制，本研究為中醫(yī)藥防治慢性腎功能衰竭提供了新的思路。

Figure 3. Expression of proteins in renal interstitial fibroblasts in 20 weeks detected by Western blotting.1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group.Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs model group.

[參 考 文 獻(xiàn)]

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