茍亞峰等

摘 要 采用液-液分配法對圓滑番荔枝葉乙醇提取物進行萃取分離，得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯等不同萃取組分。采用生長速率法測定不同萃取組分對胡椒瘟病菌的抑制作用。結果表明：乙酸乙酯萃取組分對胡椒瘟病菌的抑制作用最強，其中20 mg/mL乙酸乙酯萃取組分對胡椒瘟病菌菌絲生長的抑制率達到74.43%，具有較好的抑菌效果。

關鍵詞 圓滑番荔枝葉 ；萃取組分 ；胡椒瘟病菌 ；抑菌活性

分類號 S667.9 ；S435.72

Determination of the Antifungal Activity of Ethanol Extracts from

Annona glabra Leaf against Phytophthora capsici

GOU Yafeng1，2） SUN Shiwei1，2） GAO Shengfeng1，2） SANG Liwei1，2） LIU Aiqin1，2）

（1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533；

2 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for

Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533）

Abstract Annona glabra leaf ethanol extracts were extracted by liquid - liquid partition method. Getting different petroleum ether， trichloromethane， ethyl acetate extract components. Testing the different components antifungal activity against Phytophthora capsici with growth rate method. The results showed that the ethyl acetate extract components had high inhibition rate against Phytophthora capsici mycelium growth. When the concentration was 20 mg/mL， the inhibition rate reached to 74.43%.

Keywords Annona glabra leaf ； extract components ； Phytophthora capsici ； antifungal activity 胡椒瘟病是一種由疫霉屬病原菌（Phytophthora capsici）引起的傳染力很強的土傳病害，常在雨季時發(fā)生[1]。胡椒瘟病是胡椒生產中災難性病害，病害發(fā)生輕微時，可使胡椒產量損失5%-30%；感病嚴重的胡椒可整株萎蔫枯死，損失達90%，造成嚴重的經濟損失[2-3]。目前國內防治胡椒瘟病主要以化學防治技術為主[4-6]。國外Kasim R研究了甲霜靈、疫霜靈等對胡椒瘟病的室內和大田防治效果[7]。由于長期使用化學農藥不僅容易引起抗藥性，而且容易破壞胡椒園的生態(tài)環(huán)境和降低胡椒產品品質。

圓滑番荔枝（Annona glabra Linn.）是番荔枝科番荔枝屬植物。番荔枝科植物具有抗病毒、蟲、抗癌等多種生理活性。早在1982年由M.Leboeuf等報道番荔枝科植物中含有各種生物堿、糖類、脂肪酸、氨基酸、蛋白質、多酚類、揮發(fā)油、帖類及各式芳香性化合物。田娟[8]、志明[9]等從圓滑番荔枝中分離得到萜烯類、生物堿等化合物，該類化合物已報道具有很強的抗癌作用。有研究報道圓滑番荔枝乙醇提取物對胡椒瘟病菌菌絲生長有較好的抑制作用[10]。因此，本實驗以胡椒瘟病菌為供試病原菌，測定圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同萃取組分對胡椒瘟病菌的抑菌活性，為進一步分離抑制胡椒瘟病菌的活性成分奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物

圓滑番荔枝（Annona glabra Linn.）采于中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所。將新鮮的圓滑番荔枝葉充分陰干，磨碎過40目篩后置通風、避光處儲藏備用。

1.1.2 病原菌

胡椒瘟病菌（Phytophthora capsici）由中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所病蟲害防控研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 圓滑番荔枝提取物的制備

冷浸法：準確稱取2 kg的圓滑番荔枝葉干粉裝入廣口瓶中，加入干粉5倍量的乙醇浸提48 h并將濾液減壓濃縮，依次重復3次，合并3次的濃縮液放置4℃冰箱內備用。

1.2.2 圓滑番荔枝提取物不同萃取物的制備

液-液萃取法：準確稱取圓滑番荔枝葉乙醇提取物浸膏5 g加入10倍量的蒸餾水，裝入分液漏斗中混勻，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯各萃取3次，每次50 mL。分別合并各溶劑萃取液，減壓濃縮分別得圓滑番荔枝葉乙醇提取物石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分浸膏，備用（圖1）。

1.2.3 圓滑番荔枝提取物不同萃取組分對胡椒瘟病菌的影響

菌絲生長速率法：準確稱取0.4 g圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同萃取物浸膏，先用1 mL無水乙醇助溶，再用無菌蒸餾水定容至20 mL，制成20 mg/mL的萃取物母液。采用倍半稀釋法用無菌蒸餾水稀釋，依次制成濃度為10、5、2.5、1.25 mg/mL藥液。然后將培養(yǎng)基融化并冷卻至50℃左右時，把1 mL不同濃度的圓滑番荔枝萃取組分分別與9 mL/皿的PDA培養(yǎng)基混合，搖勻待其凝固后，取菌落直徑為6 mm、培養(yǎng)好的胡椒瘟病菌的外層菌塊放置于培養(yǎng)皿中央，以加入等體積萃取溶劑滅菌水的PDA培養(yǎng)平板為對照，每個處理做3個皿重復。接種后，在人工氣候培養(yǎng)箱（25～28℃）下培養(yǎng)5 d后，采用十字交叉法分別測量菌落直徑，求其平均值，按下式計算抑菌率。endprint

2 結果與分析

2.1 圓滑番荔枝葉提取率

供試植物采用冷浸提的方法提取，并減壓濃縮至浸膏，得圓滑番荔枝葉提取率為17.15%。

2.2 圓滑番荔枝葉提取物不同萃取組分對胡椒瘟病菌活性測定

圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同溶劑萃取組分分別用倍半稀釋法配成5個梯度濃度（20、10、5、2.5、1.25 mg/mL），對胡椒瘟病菌進行抑菌活性測定，測定結果見圖2。

從圖2中可以看出，在供試濃度下，乙酸乙酯萃取組分對胡椒瘟病菌的抑菌率均高于石油醚和三氯甲烷萃取組分。當供試濃度為20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌率分別為34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取組分的抑菌率最高，達到74.43%，具有較好的抑菌效果。

3 討論與結果

從植物中尋找新型、具抑菌活性的天然化合物，并對其進行適當的結構修飾，以篩選出活性更高的新化合物，是當前植物源殺菌劑研究的重點。從以上的結果可以得出，石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取圓滑番荔枝葉乙醇提取物各組分對胡椒瘟病菌的抑菌活性具有較大差異。當供試濃度為20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌率分別為34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取組分對胡椒瘟病菌菌絲生長的抑制作用最高，達到74.43%。由此可見，從圓滑番荔枝葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中分離對胡椒瘟病菌具有抑菌作用的活性成分具有廣闊前景，為進一步研發(fā)高效、低毒、環(huán)境友好型的植物源殺菌劑奠定了基礎，對胡椒安全生產和胡椒產業(yè)的發(fā)展具有一定促進作用。

參考文獻

[1] 桑利偉，譚樂和，劉愛勤，等. 海南省胡椒主要病害現(xiàn)狀初步調查[J]. 植物保護，2010，36（5）：133-138.

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[8] 田麗娟，楊念云，孟正木，等. 圓滑番荔枝的化學成分研究[J]. 中國藥學雜志，2003，38（4）：258-260.

[9] 畢志明，蒯玉花，李 萍，等. 圓滑番荔枝樹皮中的化學成分[J]. 江蘇：藥學與臨床研究，2006，14（1）：38-39.

[10] 茍亞峰，劉愛勤，孫世偉，等. 23種植物提取物對胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J]. 2010，36（6）：128-131.endprint

2 結果與分析

2.1 圓滑番荔枝葉提取率

供試植物采用冷浸提的方法提取，并減壓濃縮至浸膏，得圓滑番荔枝葉提取率為17.15%。

2.2 圓滑番荔枝葉提取物不同萃取組分對胡椒瘟病菌活性測定

圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同溶劑萃取組分分別用倍半稀釋法配成5個梯度濃度（20、10、5、2.5、1.25 mg/mL），對胡椒瘟病菌進行抑菌活性測定，測定結果見圖2。

從圖2中可以看出，在供試濃度下，乙酸乙酯萃取組分對胡椒瘟病菌的抑菌率均高于石油醚和三氯甲烷萃取組分。當供試濃度為20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌率分別為34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取組分的抑菌率最高，達到74.43%，具有較好的抑菌效果。

3 討論與結果

從植物中尋找新型、具抑菌活性的天然化合物，并對其進行適當的結構修飾，以篩選出活性更高的新化合物，是當前植物源殺菌劑研究的重點。從以上的結果可以得出，石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取圓滑番荔枝葉乙醇提取物各組分對胡椒瘟病菌的抑菌活性具有較大差異。當供試濃度為20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌率分別為34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取組分對胡椒瘟病菌菌絲生長的抑制作用最高，達到74.43%。由此可見，從圓滑番荔枝葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中分離對胡椒瘟病菌具有抑菌作用的活性成分具有廣闊前景，為進一步研發(fā)高效、低毒、環(huán)境友好型的植物源殺菌劑奠定了基礎，對胡椒安全生產和胡椒產業(yè)的發(fā)展具有一定促進作用。

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[10] 茍亞峰，劉愛勤，孫世偉，等. 23種植物提取物對胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J]. 2010，36（6）：128-131.endprint

2 結果與分析

2.1 圓滑番荔枝葉提取率

供試植物采用冷浸提的方法提取，并減壓濃縮至浸膏，得圓滑番荔枝葉提取率為17.15%。

2.2 圓滑番荔枝葉提取物不同萃取組分對胡椒瘟病菌活性測定

圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同溶劑萃取組分分別用倍半稀釋法配成5個梯度濃度（20、10、5、2.5、1.25 mg/mL），對胡椒瘟病菌進行抑菌活性測定，測定結果見圖2。

從圖2中可以看出，在供試濃度下，乙酸乙酯萃取組分對胡椒瘟病菌的抑菌率均高于石油醚和三氯甲烷萃取組分。當供試濃度為20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌率分別為34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取組分的抑菌率最高，達到74.43%，具有較好的抑菌效果。

3 討論與結果

從植物中尋找新型、具抑菌活性的天然化合物，并對其進行適當的結構修飾，以篩選出活性更高的新化合物，是當前植物源殺菌劑研究的重點。從以上的結果可以得出，石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取圓滑番荔枝葉乙醇提取物各組分對胡椒瘟病菌的抑菌活性具有較大差異。當供試濃度為20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌率分別為34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取組分對胡椒瘟病菌菌絲生長的抑制作用最高，達到74.43%。由此可見，從圓滑番荔枝葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中分離對胡椒瘟病菌具有抑菌作用的活性成分具有廣闊前景，為進一步研發(fā)高效、低毒、環(huán)境友好型的植物源殺菌劑奠定了基礎，對胡椒安全生產和胡椒產業(yè)的發(fā)展具有一定促進作用。

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[10] 茍亞峰，劉愛勤，孫世偉，等. 23種植物提取物對胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J]. 2010，36（6）：128-131.endprint