王吉博，曾 旋，彭 浩，王鳳宇，王兆杰

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041)

GJIC漸弱劑18α-甘草次酸對兔脂肪細胞向成骨細胞橫向分化的影響

王吉博，曾 旋，彭 浩，王鳳宇，王兆杰

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041)

目的 探討縫隙連接通訊漸弱劑18α-甘草次酸(GA)對脂肪細胞向成骨細胞橫向分化及細胞間縫隙連接通訊的影響。方法 選取3月齡新西蘭大白兔腹股溝處脂肪組織，分離提取成熟脂肪細胞，使其去分化得到去分化脂肪細胞，取第三代去分化的脂肪細胞進行成骨誘導，加入GJIC漸弱劑18α-GA設為減弱組，并設立對照組，MTT法觀察18α-GA對細胞倍增是否有影響，進行茜素紅鈣結節(jié)染色和I型膠原免疫組化染色對成骨細胞定性檢測，Western blot技術和劃痕標記染料示蹤法檢測縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達。結果 MTT法檢測結果顯示18α-GA對細胞生長增殖無顯著影響。茜素紅染色顯示均發(fā)現紫紅色結節(jié)。免疫組化染色顯示減弱組I型膠原表達減弱，SLDT 法顯示減弱組熒光染料擴散低于對照組，Western blot技術檢測結果顯示減弱組Cx43蛋白的表達下降。結論 18α-GA可以減弱縫隙連接通訊以降低脂肪細胞向成骨細胞分化的能力。

脂肪細胞；成骨細胞；去分化；縫隙連接通訊；18α-甘草次酸

骨質疏松癥作為臨床上的常見病、多發(fā)病，主要以成骨細胞數量的減少為特征，同時發(fā)現骨組織中脂肪細胞數量增多，此現象的發(fā)生機制尚不明確。國內外研究多從骨髓間干細胞定向分化和調控角度考慮，較少從兩種細胞的橫向分化和細胞間信號傳導調控角度考慮。但成骨細胞和脂肪細胞間的橫向分化已經得到證實[1]。因此，本研究探討了是否能夠通過調控細胞間縫隙連接通訊(GJIC)來干預脂肪細胞向成骨細胞的橫向分化，旨在為骨量減少性疾病提供一種新的理論依據，以期達到治療骨量減少性疾病的目的。

1 實驗資料

1.1 材料 體質量2.3～2.5 kg新西蘭大白兔，DMEM/F12培養(yǎng)液(武漢博士德生物工程有限公司)等。

1.2 主要實驗試劑配制

1.2.1 成骨誘導液配制 在新配制的基礎培養(yǎng)基(含10%FBS)中依次加入100 mmol/L的地塞米松、0.05 mmol/L的維生素C、10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉，0.22 μm微孔濾器過濾除菌后4 ℃冰箱保存。

1.2.2 GJIC減弱劑的配置 將250 mg 18α-甘草次酸(GA)溶于45 mL無水乙醇中，充分攪拌，加入200 mL成骨誘導液中，0.22 μm微孔濾器過濾除菌后4 ℃冰箱保存。

1.3 方法

1.3.1 提取成熟的脂肪細胞 將3月齡健康新西蘭大白兔空氣栓塞法處死，置于無菌臺上。取無菌培養(yǎng)皿1個，加入適量PBS液。在雙腹股溝處取皮下脂肪組織約2 g，置于此無菌培養(yǎng)皿中。在無菌條件下，去除表面的結締組織，并剪成糊狀，移入15 mL離心管中，在離心管中滴入0.1% I型膠原酶3 mL，蓋好瓶蓋，置于37 ℃水浴箱中進行消化，30 min，每3 min震蕩1次，加入含1%FBS體積分數的DMEM培養(yǎng)液6 mL終止消化，180 r/min離心10 min。收集上層液體，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，采用天花板貼壁法培養(yǎng)成熟的脂肪細胞。

1.3.2 成熟脂肪細胞去分化 10 d后繼續(xù)在低氧低營養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)，使其脫去脂滴，得到去分化脂肪細胞(DA)，其后采用正常培養(yǎng)(10%FBS的DMEM培養(yǎng)液)，每2 d更換1次培養(yǎng)液。待完全脫去脂滴呈長梭形、融合達80%時，進行傳代。

1.3.3 分組并向成骨細胞誘導 選取第3代的去分化脂肪細胞，隨機分為減弱組和對照組，減弱組中加入含18α-GA的成骨誘導液，對照組加入成骨誘導液。培養(yǎng)過程中光鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.3.4 MTT法檢測細胞毒性作用 分組后的細胞按1×103個/孔接種于96孔板內，向成骨細胞誘導后的第2天起，2組各取6個孔，檢測各孔在490 nm下的吸光度(A)值，每天各取6孔進行檢測，共檢測7 d，并繪制2組細胞的生長曲線。

1.3.5 茜素紅染色 取誘導后14 d的細胞，用無水乙醇進行固定，30 min后棄固定液，沖洗3遍后加入0.1%的茜素紅Tris-HCL(pH 8.3)染色液染色30 min。

1.3.6 Ⅰ型膠原免疫細胞化學染色 誘導2周后進行Ⅰ型膠原免疫細胞化學染色，吸去誘導液，用PBS沖洗3遍，每次沖洗2 min，加入4%的多聚甲醛固定30 min，根據免疫組化試劑盒要求染色。

1.3.7 劃痕標記染料示蹤(SLDT) 將2組細胞誘導2周后接種于35 mm直徑培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞匯合成均勻單層細胞后，PBS沖洗3遍，加入熒光黃(LY)溶液，用手術刀刀刃在培養(yǎng)皿中央做一直線劃痕,5 min后用4%多聚甲醛固定3 min。用熒光倒置顯微鏡拍攝LY擴散情況，LY擴散距離使用計算機圖像進行測量。

1.3.8 Western blot技術檢測Cx43蛋白的表達 取誘導后的2組細胞，各取3 mL 4 ℃預冷的PBS液加入2個培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶平放入搖箱中搖動1 min，以充分洗滌細胞，棄去洗液。以同樣的方法洗滌細胞2次，然后將培養(yǎng)瓶置于冰上。按Western blot試劑盒步驟進行操作，并進行曝光得到X線膠片。所得X線膠片用Chemi Imager 5500 V2.0軟件掃描，通過Fluor Chert2.0軟件進行定量分析，測得整合光密度值。

2 結 果

2.1 成熟脂肪細胞的去分化 成熟脂肪細胞于24 h開始貼壁生長，形狀呈圓形空泡狀，見圖1；從48 h開始，圓形空泡狀的脂肪細胞的胞質開始向周圍伸展，第4天部分細胞胞質中的單個脂滴分裂成多個脂滴并向中央聚集，細胞形態(tài)逐漸由圓形變?yōu)闄E圓形，見圖2；在此環(huán)境下的第10天開始細胞逐漸伸展，形成不規(guī)則形狀并且平鋪于培養(yǎng)瓶底部，見圖3；14 d后梭形細胞逐漸增多，形態(tài)為成纖維細胞狀細胞，并且貼服于培養(yǎng)瓶的底部，脂肪細胞完全去分化，見圖4。

圖1 原代成熟脂肪細胞(×100)

圖2 成熟脂肪細胞去分化4 d(×200)

圖3 成熟脂肪細胞去分化10 d(×100)

圖4 去分化脂肪細胞(×100)

2.2 細胞生長曲線及倍增時間 以每個時間點所測的2組各孔A值的算數平均值為縱坐標，以所測的時間為橫坐標，用Excel 2003軟件繪制出散點折線圖，可以發(fā)現隨著時間的變化A值隨之增加，1～2 d 2組細胞為生長停滯期，指數生長期從第3天開始，均在第6天進入平臺生長期。曲線大致呈“S”形，2組細胞生長的總體趨勢變化不大，見圖5。經計算對照組細胞的倍增時間約為60.96 h，減弱組倍增時間約為59.70 h，組間進行單因素方差分析，P=0.982，差異無統(tǒng)計學意義，表明縫隙連接通訊減弱劑18α-GA對去分化脂肪細胞生長增殖無顯著影響。

圖5 2組DA的生長曲線

2.3 茜素紅鈣結節(jié)染色 鏡下觀察可見2組細胞均有被染成紫紅色的鈣結節(jié)，見圖6和圖7。

圖6 減弱組DA誘導14 d茜素紅染色(×100)

圖7 對照組DA誘導14 d茜素紅染色(×100)

2.4 SLDT法檢測GJIC的強弱 結果顯示減弱組為4～5層，見圖8；對照組為7～8層，見圖9。

2.5 Ⅰ型膠原免疫細胞化學染色 染色后鏡下觀察發(fā)現2組胞漿內均有棕黃色顆粒沉積，見圖10及圖11；對灰度值進行統(tǒng)計學分析，減弱組為134.551±7.301，對照組為125.497±9.230，2組比較有顯著性差異(P<0.05)。

2.6 Western blot技術檢測Cx43蛋白的表達 Cx43蛋白的相對分子量為45×103，減弱組的條帶要弱于對照組并且顏色較淺，見圖12。測得整合光密度值減弱組為44158.92±1 356.94，對照組為48 519.19±1 678.5，2組比較有顯著性差異(P<0.05)。

圖8 SLDT法檢測減弱組熒光黃擴散距離(×100)

圖9 SLDT法檢測對照組熒光黃擴散距離(×100)

圖10 減弱組DA誘導14 d Ⅰ型膠原免疫組化

圖11 對照組DA誘導14 d Ⅰ型膠原免疫組化

3 討 論

GJIC廣泛存在于人體的各個系統(tǒng)中，目前研究比較多并取得一定進展的有神經系統(tǒng)和心血管等系統(tǒng)，成骨細胞和脂肪細胞間也存在廣泛的縫隙連接，連接介導的GJIC對2種細胞的代謝、生長、增殖及分化起到非常重要的作用，而此兩種細胞存在相同的表型，改變GJIC可能影響脂肪細胞向成骨細胞的轉換。

圖12 Western blot技術檢測Cx43蛋白的表達

GJIC的組成單位為縫隙連接蛋白(Cx)，通過調控Cx的生成、Cx的轉運及連接子的耦聯情況，可以調節(jié)縫隙連接的數量，從而調控GJIC。GJIC在維持細胞間信息的傳遞，調節(jié)細胞增殖、分化及維持組織內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等過程中起著十分重要的作用[2-3]。目前研究發(fā)現，18α-GA[4]、油酸酰胺、生胃酮等對GJIC有減弱作用。有研究表明，成骨細胞和骨細胞中主要表達Cx43[5]，而Cx43與骨骼的正常發(fā)育密切相關，Cx介導的GJIC在骨骼發(fā)育、塑形中扮演尤為重要的角色[6]，可通過調節(jié)成骨細胞的增殖、分化及存活等生物學過程而影響骨骼的發(fā)育、塑形[7]。

本實驗選用Western blot技術檢測成骨細胞中Cx43蛋白的表達，發(fā)現減弱組Cx43的量明顯少于對照組，說明18α-GA對GJIC具有調控作用，通過改變Cx的生成和轉運使其在細胞與細胞之間產生了更少的縫隙連接結構。直觀的SLDT法檢測GJIC功能，發(fā)現單位時間內減弱組LY的擴散細胞層數明顯少于對照組，說明細胞與細胞之間產生更少的縫隙連接結構的基礎上，可以使單位時間細胞與細胞之間的信息交換量明顯減少。

成熟的脂肪細胞在缺氧缺營養(yǎng)的培養(yǎng)條件下能夠去分化為成纖維樣細胞，這種細胞在成骨誘導環(huán)境下具有分化為成骨細胞的能力[8]。因此本研究選用3月齡新西蘭大白兔，提取成熟脂肪細胞。成熟脂肪細胞采用天花板貼壁法在缺氧缺營養(yǎng)環(huán)境下進行培養(yǎng)，鏡下觀察到成熟的脂肪細胞第4天開始逐漸脫去脂滴，10 d左右去分化成功得到高純度去分化脂肪細胞。通過MTT法檢測發(fā)現18α-GA對去分化脂肪細胞向成骨誘導過程中對細胞增殖無顯著影響。另外鈣結節(jié)為成骨細胞進入成熟期的標志[9]，成骨細胞的成熟在骨形成的過程中至關重要。本實驗中2組細胞于誘導2周后行茜素紅鈣結節(jié)染色，均有鈣結節(jié)被染成了紫紅色，說明成骨誘導脂肪細胞成功分化為成骨細胞，并能聚集鈣離子，促進細胞外基質礦化，使成骨細胞進入了成熟期。而I型膠原是成骨細胞分化

過程中的早期標志之一，在骨發(fā)育中I型膠原起重要作用，I型膠原缺失會造成成骨細胞發(fā)育停滯。本實驗結果顯示減弱組胞漿內I型膠原含量少于對照組，這說明減弱GJIC可以產生更少的Ⅰ型膠原，減慢骨基質重建進程。

綜上所述，成熟的脂肪細胞能夠去分化并且得到了去分化脂肪細胞，去分化脂肪細胞在成骨誘導環(huán)境下能夠橫向分化為成骨細胞，并能使之進入成熟期，參與成骨過程。而GJIC減弱劑18α-GA可通過調控Cx 的生成、Cx 的轉運及連接子的耦聯，減弱縫隙連接結構的形成，從而減少縫隙連接的數量，使得細胞與細胞間的信息傳遞減少，進而減慢了去分化脂肪細胞向成骨細胞橫向分化的速度，分化成了更少的成骨細胞并減慢了成骨細胞的成熟和骨質重建。說明影響GJIC能夠影響脂肪細胞向成骨細胞分化。下一步將探討是否可以通過增強GJIC來加速和促進脂肪細胞向成骨細胞的橫向分化，以期達到治療和預防骨量減少性疾病，為臨床開發(fā)新藥提供新的理論和依據。

[1] 王兆杰，安榮澤，張弛，等. 兔成骨細胞和脂肪細胞橫向分化的研究[J]. 中華實驗外科雜志，2012,29(7):1262-1264

[2] Collignon H,Davicco MJ,Barlet JP. lsolation of cells from oxine fetal long bone and characterization of their osteoblastic activities during in vitro mineralization[J]. Arch Physiol Biochem,1997,105(2):158-166

[3] Gramsch B,Gabriel HD,wiemann M,et al. Enhancement of connexin43 expression increases proliferation and differentiation of an osteoblastke cell line[J]. Exp Cell Res,2001,264(2):397-407

[4] Li Z,Zhou Z,Saunders MM,et al. Modulation of connexin43 alters expression of osteoblastic differentiation markers[J]. Am J Physiol Cell Physiol，2006，290(4):C1248-1255

[5] Zheng CY,Li XD,Du SX. The role of connexin43 in bone development and shaping[J]. International Journal of Orthopaedics,2009,30(2):134-136

[6] Koval M,Harley JE,Hick E,et al. Connexin46 is retained as monomers in a trans-Golgi compartment of osteoblastic cells[J]. Cell Biol，1997，137(4):847-857

[7] Matsuo K. Cross-talk among bone cells[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens，2009，18(4):292-297

[8] 康鵬德，裴福興，楊靜，等. 骨髓脂肪細胞向成骨細胞的轉分化[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2011,15(1):17-22

[9] 李大為，秦林林. 異黃酮類藥Genistein對原代培養(yǎng)細胞大鼠成骨細胞增殖、分化、鈣含量及礦化功能的影響[J]. 中華骨質疏松雜志，2002，8(4)：307-310；34

Effects of GJIC diminuendo agent 18α-GA on transdifferentiation from adipocytes to osteoblasts in rabbits

Wang Jibo, Zeng Xuan, Peng Hao, Wang Fengyu, Wang Zhaojie

(Zhuhai Campus of Zunyi Medical College，Zhuhai 519041, Guangdong, China)

Objective It is to explore the effects of transdifferentiation from adipocytes to osteoblasts and gap junction intercellular communication(GJIC) by gap junction Diminuendo agent 18α-GA. Methods Groin adipose tissue was taken from 3 months old New Zealand White Rabbit and collected mature adipocytes. Made the mature adipocytes dedifferentiate and obtained the dedifferentiated adipocytes. The 3rd generation of the dedifferentiated adipocytes were induced and differentiated into osteoblasts. There were two experimental groups that the diminuendo group with adding 18α-GA and the control group. The toxic action of 18α-GA in osteoblasts growth and proliferation were detected by MTT assay. Osteoblasts were qualitatively detected by alizarin red staining and collagen typeⅠ immunohistochemistry staining. The expressions of Cx43 were measured by Western-blot and sorape-loading and dye transfet (SLDT) method. Results The results of MTT assay showed that 18α-GA had no significant effect on cell proliferation. The results of Alizarin red staining showed that calcific nodules were dyed red in each group. Immunohistochemistry staining results showed that the expressions of collagen typeⅠ were weakened in the diminuendo group. The results of Western blot showed that the expressions of Cx43 were decreased in the diminuendo group. Conclusion 18α-GA diminuendo the capability of transdifferentiation from adipocytes to osteoblasts with enhancement of GJIC.

adipocytes; osteoblasts; dedifferentiated; gap junction intercellular communication; 18α-GA

王吉博，男，碩士，助教，主要從事外科學教學及科研工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.34.009

R-332

A

1008-8849(2014)34-3793-04

2014-04-05