徐 巖，許佳明，何 璐，姬朝光，黃曉巍*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130021)

鹿茸多肽是從新鮮鹿茸中提取的一類多肽類物質(zhì)，具較強(qiáng)的生物活性，鹿茸多肽具促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化等多重作用[1]，并具有抗腫瘤等作用[2]。盡管鹿茸多肽抗腫瘤的確切機(jī)制尚不十分清楚，但研究表明，鹿茸多肽的抗腫瘤作用可能通過不同的信號傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤新生血管形成，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。鹿茸多肽對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)作用未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞系，人膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251)腫瘤細(xì)胞系由吉林大學(xué)免疫學(xué)系保存；鹿茸多肽，長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供；碘化丙啶PI(美國Sigma公司)，以PBS配制成1.0 mg/mL濃度，過濾除菌后避光備用；MTT(美國Gibco公司)，臨用前以PBS配制成5 mg/mL濃度，過濾除菌后避光備用；二甲基亞砜DMSO和0.25%胰蛋白酶(美國Amresco公司)；RPMI-1640(美國Gibco公司)；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)。

1.2 儀器 標(biāo)準(zhǔn)超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；MCO-17AIC型CO2孵箱(日本三洋公司)；DT5-3型低速自動平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；Multiskan Ascent酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems公司)；BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences)。

1.3 方法

1.3.1 U251細(xì)胞株傳代培養(yǎng)條件 U251細(xì)胞貼壁生長在含有10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中。在37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，每2～3天消化1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 試劑的配制 將鹿茸多肽溶解在PBS配制成1.0 mg/mL濃度，過濾除菌后，分裝后-20 ℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)當(dāng)日用不完全培養(yǎng)基配制鹿茸多肽工作液。

1.3.3 細(xì)胞生長抑制率測定(MTT法) 取對數(shù)生長期U251腫瘤細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基制成1×107細(xì)胞懸液。加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后，更換含有50，100，200，400，800 μg/mL鹿茸多肽的培養(yǎng)液，對照組為完全培養(yǎng)基，每組設(shè)12個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后傾去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，繼續(xù)孵育4 h，傾去MTT溶液，每孔加DMSO 100 μL，振蕩10 min然后在酶標(biāo)儀上570 nm波長處測吸光度(OD值)。

1.3.4 細(xì)胞周期變化的檢測(FCM法) 取對數(shù)生長期U251細(xì)胞接種至50 mL培養(yǎng)瓶中,細(xì)胞濃度為5×106個/瓶。培養(yǎng)24 h后，更換含有50，100，200，400，800 μg/mL鹿茸多肽的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，對照組為完全培養(yǎng)基。然后用0.25%胰酶消化細(xì)胞，離心(1 000 r/min,5 min),PBS漂洗并重懸；用終濃度50%冷乙醇4 ℃固定過夜，用PBS洗脫乙醇2次，3 000 r/min,10 min；加碘化丙啶(PI)染色，終濃度為50 μg/mL,4 ℃避光染色30 min，用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 鹿茸多肽對U251腫瘤細(xì)胞的增殖作用的影響 MTT法檢測結(jié)果表明，與對照組比較,鹿茸多肽組腫瘤細(xì)胞抑制率顯著增加，抑制率隨藥物濃度的增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。表明鹿茸多肽對腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯的抑制效應(yīng)。結(jié)果見表1。

表1 不同劑量鹿茸多肽對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用的比較(n=12)

鹿茸多肽/(μg/mL)OD570 nm均值抑制率/% 00.353 — 500.331 6.231000.29516.432000.27821.254000.25727.208000.24530.59

2.2 鹿茸多肽對U251腫瘤細(xì)胞周期的變化的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明,從圖1中可以看到在二倍體峰前出現(xiàn)了一個凋亡峰，凋亡峰所占的百分比分別為0.57%、0.68%，1.42%,1.82%，2.23%?？梢姷绞勾罅刻幱谠鲋称诘募?xì)胞阻滯于G0/G1期，不能進(jìn)行增殖而表現(xiàn)為G0/G1期比例增高，部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，其凋亡峰是低無到高，且逐漸增高,與對照組相比有一定差異，見表2。

表2 不同劑量鹿茸多肽對U251腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

3 討論

細(xì)胞凋亡是腫瘤細(xì)胞抑制的重要路徑之一，許多抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而起作用[3]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)的機(jī)制研究受到了人們的廣泛關(guān)注。 細(xì)胞凋亡[4]指在一定生理和病理情況下機(jī)體為維護(hù)內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定,通過基因調(diào)控，誘導(dǎo)、啟動來實(shí)施細(xì)胞凋亡，是自身細(xì)胞的主動死亡過程。細(xì)胞凋亡與增殖是一對并存的矛盾，正常狀況兩者維持動態(tài)平衡，當(dāng)細(xì)胞增殖與死亡的速度平衡失調(diào)時，則會增加腫瘤發(fā)生的可能性。 許多抗腫瘤藥物可以通過干擾腫瘤細(xì)胞生長、代謝、增殖等過程，最終觸發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。 研究表明，許多中藥的抑瘤作用[5]通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制實(shí)現(xiàn)的,因此中藥抗腫瘤作用機(jī)制的研究有助于人們尋找適合的藥物治療腫瘤，同時更能進(jìn)一步提示凋亡機(jī)制的發(fā)生[6-7]。 鹿茸多肽是從新鮮鹿茸中提取的一類多肽類物質(zhì)，具較強(qiáng)的生物活性[8],鹿茸多肽對骨組織、神經(jīng)纖維損傷的修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用[9]。對細(xì)胞的增殖和分化有明顯的調(diào)節(jié)作用。 細(xì)胞發(fā)生中一個密切而又獨(dú)立的危險事件就是細(xì)胞周期變化，藥物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡時多伴有細(xì)胞周期的阻滯，通過阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，使細(xì)胞阻滯于G1期,并使G1期細(xì)胞凋亡。 本實(shí)驗(yàn)研究了鹿茸多肽對腫瘤細(xì)胞生長增殖的抑制及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。通過對鹿茸多肽作用于細(xì)胞48 h后的細(xì)胞形態(tài)的觀察和MTT法細(xì)胞生長抑制率[10]的測定及流式細(xì)胞儀[11]檢測細(xì)胞周期。結(jié)果表明,大量處于增殖期的細(xì)胞阻滯于G0/G1期，不能進(jìn)行增殖而表現(xiàn)為G0/Gl期比例增高,部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡峰隨著濃度的增加而增高，說明鹿茸多肽誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用存在著濃度依賴性。

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