張延英，汪永鋒，張艷霞，李存祥，康萬(wàn)榮

(甘肅中醫(yī)學(xué)院 甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

急性胰腺炎(acute Pancreatitis，AP)是一種由胰酶激活引起的常見(jiàn)急腹癥之一，由于胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)酶原異常激活，導(dǎo)致胰腺局部炎癥反應(yīng)，其發(fā)病急、病程快、并發(fā)癥多、病情危重、死亡率高，中醫(yī)將之歸屬于“結(jié)胸”“陽(yáng)明腑實(shí)證”等范疇，用通里攻下治療[1]。經(jīng)中醫(yī)臨床應(yīng)用證明，大黃牡丹湯組方(RPDP)具有清熱解毒，通里攻下，活血涼血，消痞除滿等功效，對(duì)AP有很好的療效。近年來(lái)，有研究對(duì)細(xì)胞凋亡在急性胰腺炎發(fā)病中所起的作用進(jìn)行了探索，但RPDP對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制的研究較少。本研究將對(duì)一次口服給予RPDP后急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡情況及其機(jī)制進(jìn)行觀察。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和屏障實(shí)驗(yàn)室均由甘肅中醫(yī)學(xué)院提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001，使用許可證號(hào):SYXK(甘)2011-0001；SPF雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～260 g。將60只SD大鼠隨機(jī)分為藥物作用12 h假手術(shù)(SO)組、模型組和RPDP組，藥物作用24 h SO組、模型組和RPDP組，每組各10只。分別于RPDP治療后12 h和24 h后處死大鼠并取材。

1.2 藥物、主要試劑與儀器 RPDP由甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制成生藥濃度為4 kg/L的藥液。?；悄懰徕c、TUNEL試劑盒、血清淀粉酶、一氧化氮(NO)和誘生型iNOS測(cè)定試劑盒均購(gòu)自蘭州碩達(dá)生物技術(shù)公司。所需儀器設(shè)備由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 AP模型的建立、治療和取材 SPF級(jí)SD大鼠分為藥物作用12 h SO組、AP模型組和RPDP治療組，藥物作用24 h SO組、AP模型組和RPDP治療組。SO組大鼠在開(kāi)腹后僅輕輕翻動(dòng)胰腺和胰膽管然后關(guān)腹。大鼠禁食，自由飲水12 h后，3%戊巴比妥麻醉下，經(jīng)上腹部正中切口進(jìn)入腹腔，提起胃、十二指腸，顯露出胰腺，確認(rèn)膽胰管，在其近端和遠(yuǎn)端均以動(dòng)脈夾暫時(shí)結(jié)扎，將帶有四號(hào)針頭的1 mL注射器沿十二指腸壁漿肌層穿刺距離膽胰管開(kāi)口0.3 mm處的膽管，注入3.5%的?；悄懰徕c0.1 mL/100 g，以0.1 mL/min的速度注射完成，停留5 min，去除結(jié)扎線，指壓穿刺點(diǎn)，查無(wú)漏膽，逐層關(guān)腹。對(duì)照組僅牽引胰腺和十二指腸后關(guān)腹[2]。術(shù)后10～15 min清醒后限制飲水，籠中自由活動(dòng)。建立大鼠AP模型，造模后2 h灌胃，治療組給予RPDP劑量為40 g/kg(10 mL/kg)灌胃1次，相當(dāng)于成人劑量的20倍，模型組和SO組用等量的生理鹽水灌胃1次。給藥后12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間段麻醉股動(dòng)脈取血,每只動(dòng)物分兩個(gè)采血管，肝素抗凝管分離血漿，普通管分離血清；取血后開(kāi)腹取胰腺組織，胰體迅速制備勻漿，檢測(cè)胰腺組織中NO含量和iNOS的活性;胰頭組織完全浸入4%多聚甲醛,每日更換1次4%多聚甲醛，3 d后用石蠟包埋，用原位缺口末端標(biāo)記法檢測(cè)胰腺組織細(xì)胞凋亡率。

1.4 血清淀粉酶，胰腺組織N0含量、iNOS活性和腺泡細(xì)胞凋亡測(cè)定 用普通采血管分離血清，檢測(cè)血清淀粉酶；檢測(cè)胰腺組織勻漿中NO含量和iNOS活性，按照NO含量和iNOS活性試劑盒提供的方法進(jìn)行檢測(cè),用TUNEL凋亡細(xì)胞試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量檢測(cè)胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡。用盲法計(jì)數(shù)，選取每張TUNEL陽(yáng)性切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多的高倍視野8個(gè)，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞和其中的凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/800×100%。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)后觀察 取血后開(kāi)腹觀察胰腺，模型組和治療組有腹水，胰腺局部腫脹變硬，模型組的壞死灶比治療組多；SO組腹腔內(nèi)未見(jiàn)腹水和其他異常，胰腺正常。

2.2 血清淀粉酶活性 AP模型組血清淀粉酶顯著高于SO組；與AP模型組比較，RPDP治療后12 h和24 h血清淀粉酶顯著降低(P<0.05)；與12 hRPDP治療組比較，24 hRPDP治療組血清淀粉酶顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 胰腺組織NO含量和iNOS活性 AP模型大鼠胰腺組織NO含量和iNOS活性顯著低于SO組；與AP模型組比較，RPDP治療后12 h和24 h，胰腺組織內(nèi)NO含量和iNOS活性顯著升高(P<0.05)；與12 h RPDP治療組比較，24 h RPDP治療組NO含量和iNOS活性顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.4 細(xì)胞凋亡指數(shù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SO組和模型組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡發(fā)生率較低；與模型組比較，RPDP治療后12 h和24 h胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與12 h RPDP治療組比較，24 h RPDP治療組胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 RPDP對(duì)SD大鼠血清中淀粉酶、NO、iNOS和細(xì)胞凋亡的影響

注：與SO組比，#P<0.05；與12 h比，△P<0.05

3 討論

AP較輕時(shí)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡較多，很少有壞死，AP較重時(shí)胰腺腺泡細(xì)胞壞死較多，很少有細(xì)胞凋亡；胰腺腺泡細(xì)胞凋亡之后，多種酶原物質(zhì)從腺泡細(xì)胞內(nèi)釋放到腺泡細(xì)胞外，致胰腺炎癥反應(yīng)減輕[3-4]。細(xì)胞凋亡有可能是機(jī)體自我保護(hù)的一種現(xiàn)象，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，有可能減輕AP的嚴(yán)重程度。Flint RS研究說(shuō)明，病情嚴(yán)重程度與胰腺腺泡細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn),胰腺組織損害越嚴(yán)重，胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)就越低，RPDP對(duì)胰腺細(xì)胞凋亡有誘導(dǎo)作用。

胰腺腺泡細(xì)胞NO含量和iNOS活性在AP中有何作用，AP時(shí)胰腺腺泡細(xì)胞NO含量和iNOS活性顯著降低，Werner J認(rèn)為iNOS活性誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞使其NO含量增加，一定含量的NO對(duì)AP胰腺微循環(huán)有所改善，NO能保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞起到了保護(hù)作用，AP的嚴(yán)重程度減輕了[6],內(nèi)源性的NO阻斷或含量減少有可能加重AP損傷[7-8]。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，經(jīng)RPDP治療后胰腺腺泡細(xì)胞NO含量和iNOS活性增加，血清淀粉酶降低和誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Thatte U研究一致[9]。RPDP對(duì)AP胰腺組織有保護(hù)作用是通過(guò)增加胰腺組織內(nèi)NO含量和iNOS活性，協(xié)同誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)，但其作用機(jī)理還需要大量研究來(lái)進(jìn)一步闡明。

[1]高青松,劉源,張濤,等.不同類型脂肪酸對(duì)SD大鼠血清生化指標(biāo)及胰島素抵抗的影響[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2010,27(1):16-21.

[2]張馨木,孫波,李志滿,等.重組人KD/APP var對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠急性壞死性胰腺炎作用的研究[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2010,27(5):26-28.

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[5]Flint R S,Phillips A R,Power S E,et al.Acute pancreatitis severity is exacerbated by intestinal ischemia-reperfusion conditioned mesenteric lymph[J].Surgery,2008,143(3):404-413.

[6]Werner J,Fernndez-del Castillo C,Rivera J A,et al.On the protective mechanisms of nitric oxide in acute pancreatitis[J].Gut,1998,43(3):401-407.

[7]張?jiān)谂d,孫家邦,李非,等.內(nèi)源性一氧化氮對(duì)大鼠急性壞死性胰腺炎的胰腺保護(hù)作用[J].中華普通外科雜志,2000,15(10):29-31.

[8]吳濤,陳熹,紀(jì)宗正.精氨酸對(duì)急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(17):1570-1572.

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