胥亞楠， 楊 龍,△， 楊天和， 鄧春玉， 羅 淋， 覃智芳， 唐 倩， 楊 君

(1貴陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽 550002； 2遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 遵義 563003； 3廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510080)

心房顫動(dòng)(房顫)常高發(fā)于有高血壓、心力衰竭(心衰)等基礎(chǔ)疾病的患者[1]。此類基礎(chǔ)疾病促使心房容量或壓力負(fù)荷增加，對(duì)心房肌產(chǎn)生牽張刺激，促進(jìn)心房重構(gòu)[2]。心房肌細(xì)胞離子通道重構(gòu)是電重構(gòu)的基礎(chǔ)。對(duì)房顫離子通道重構(gòu)的研究涉及多種離子通道的表達(dá)和功能改變。瞬時(shí)外向鉀電流(transient outward potassium current,Ito)和內(nèi)向整流鉀電流(inward rectifier potassium current,IK1)是參與心肌細(xì)胞動(dòng)作電位(action potential, AP)復(fù)極相1、3期的主要離子流，其電流大小明顯影響AP 1、3相時(shí)程。本研究通過體外牽張模型拉伸培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞，應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法探討牽張刺激對(duì)Ito、IK1及動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration, APD)的影響。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶(Gibco),Ⅱ型膠原酶(Invitrogen),辣根過氧化酶抗兔抗體(Santa Cruz),封閉專用脫脂奶粉(普利萊公司),4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI； Biobox),硅膠膜購于SMI,5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine, 5-BrdU)、4-氨基吡啶(4-amion pyridine, 4-AP)、兔抗大鼠α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(a-sarcomeric actin, α-SCA) 抗體和環(huán)孢素A(cyclosporine A, CsA)購自于Sigma，其余試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

記錄鉀電流的細(xì)胞外液(mmol/L)：NaCl 136.0、KCl 5.4、MgCl2·6H2O 1.0、NaH2PO40.33、CaCl2·2H2O 2.0、HEPES 10.0和葡萄糖10.0，pH用NaOH調(diào)至7.4。記錄Ito時(shí)，在細(xì)胞外液中加入0.3 mmol/L CdCl2和0.5 mmol/L BaCl2分別阻斷L-型鈣電流(ICa-L)和IK1。記錄IK1時(shí)，在細(xì)胞外液中加入0.5 mmol/L 4-AP和1 μmol/L尼卡地平分別阻斷Ito和ICa-L。鉀電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl 140、MgCl2·6H2O 1.0、HEPES 10.0、EGTA 5.0、Na2·ATP 5.0，pH用KOH調(diào)至7.2。記錄動(dòng)作電位的電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl 140、MgCl2·6H2O 1.0、HEPES 10.0、EGTA 0.05、Na2·ATP 5.0，pH用KOH調(diào)至7.2。含鈣臺(tái)氏液(mmol/L)：NaCl 136、KCl 5.4、NaH2PO40.33、葡萄糖10.0、HEPES 10.0和CaCl2·2H2O 2，pH用NaOH調(diào)至7.4[3]。

2 動(dòng)物與儀器

1 日齡SD乳鼠每組9只，由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心提供，雌雄不限，許可證號(hào)為[SCXK(粵)2011-0029]。倒置顯微鏡(ZEISS AXIO型)。電極拉制儀(Narishige PP830型)。膜片鉗放大器(Axopatch700B)及附件均為Axon產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1乳鼠心房肌細(xì)胞分離與培養(yǎng) 分離乳鼠心房并剪碎。以含胰酶與Ⅱ型膠原酶的混合消化液消化6 ～ 7 min，取上層細(xì)胞懸液于10% FBS-DMEM中終止消化。重復(fù)消化、終止過程，直至組織塊完全消化。1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加適量完全培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液。采用差速貼壁與BrdU結(jié)合，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中純化培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液洗去未貼壁細(xì)胞與成纖維細(xì)胞，換含5%血清培養(yǎng)基進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)[4]。

3.2心房肌細(xì)胞免疫熒光染色鑒定 細(xì)胞爬片培養(yǎng)48 h，4%多聚甲醛室溫固定60 min，PBS洗3遍，每次5 min。5% BSA室溫封閉30 min后，加Ⅰ抗兔抗大鼠α-SCA抗體(1∶50)4 ℃過夜，PBS洗3遍，每次5 min。加Ⅱ抗羊抗兔IgG-FITC (1∶100)，37 ℃ 60 min。PBS洗3遍，復(fù)染細(xì)胞核，加入封片劑封片后，于熒光顯微鏡下觀察并攝片[4]。以乳大鼠心臟成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

3.3細(xì)胞牽張刺激 采用靜態(tài)等雙軸牽張裝置對(duì)心房肌細(xì)胞施加定量力學(xué)拉伸。牽張刺激可使細(xì)胞肥大、蛋白/DNA比值增大。本課題前期實(shí)驗(yàn)中，給予培養(yǎng)24 h的心房肌細(xì)胞增加12%硅膠膜面積牽張刺激24 h，細(xì)胞蛋白質(zhì)/DNA比值增大，證實(shí)了牽張刺激的有效性[5]。

3.4細(xì)胞干預(yù)分組 細(xì)胞培養(yǎng)于牽張裝置24 h，更換5% FBS-DMEM培養(yǎng)基。對(duì)照組不予牽張刺激；牽張組予以增加12%硅膠膜面積牽張刺激培養(yǎng)24 h。

3.5心房肌細(xì)胞Ito和IK1測(cè)定 預(yù)溫0.125%胰酶消化心房肌細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。于直徑35 mm培養(yǎng)皿中調(diào)整細(xì)胞數(shù)使其密度約為1×102，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)2～3 h使細(xì)胞貼壁。選擇立體感強(qiáng)、大小適中的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。玻璃微電極充灌電極液后電阻為2～4 MΩ。施加負(fù)壓使電極與細(xì)胞表面形成1 GΩ以上高阻抗封接。破膜，給予慢電容補(bǔ)償，形成全細(xì)胞記錄。設(shè)置鉗制電壓為-50 mV，給予指令電位-40 mV～+60 mV，步階電壓10 mV，波寬300 ms，頻率0.2 Hz的刺激，記錄Ito。記錄IK1時(shí)，將鉗制電壓設(shè)置為-40 mV，指令電壓-120 mV～+30 mV，步階電壓10 mV，波寬500 ms，頻率0.1 Hz。為避免細(xì)胞大小所造成的誤差采用電流密度分析，電流密度(pA/pF)=電流強(qiáng)度/電容。電流信號(hào)經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，由膜片鉗AXON 700B放大器放大通過AD/DA轉(zhuǎn)換板，并存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)硬盤中。實(shí)驗(yàn)由pCLAMP 10.0軟件程序刺激發(fā)放和信號(hào)采集。

3.6心房肌細(xì)胞AP測(cè)定 AP記錄同膜片鉗全細(xì)胞記錄Ito和IK1相似。區(qū)別在于采用細(xì)胞貼附技術(shù)，形成高阻封接后破膜，不予補(bǔ)償。并應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)中的電流鉗模式，給予1 nA電流脈沖，波寬5 ms，引發(fā)心房肌細(xì)胞AP。記錄并分析靜息膜電位(resting membrane potential, RMP)和動(dòng)作電位幅度(action potential amplitude, APA)和動(dòng)作電位復(fù)極50%、90%時(shí)程(APD50、APD90)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用pCLAMP 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖形轉(zhuǎn)換，運(yùn)用SigmaPlot軟件繪制離子通道電流密度-電壓曲線。用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乳大鼠心房肌細(xì)胞鑒定

由乳鼠心房組織分離、純化培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，有95%為 α-SCA抗體免疫熒光染色陽性(圖1A)，而成纖維細(xì)胞為陰性(圖1B)，表明前者為心房肌細(xì)胞。

Figure 1. α-SCA antibody immunofluorescence staining of atrial myocytes.A: the left picture is cultured for 48 hours of atrial myocytes of rabbit anti α-SCA antibody immunofluorescence staining, green is positive (×200); the right one is the same vision for nuclear with DAPI (×200)； B: the results of cardiac fibroblasts stained under the same condition of atrial myocytes.

2 牽張對(duì)乳大鼠心房肌細(xì)胞Ito的影響

2組心房肌細(xì)胞Ito在-20 mV激活，電流密度隨去極化程度增加而增大，于+60 mV達(dá)最大值。與對(duì)照組相比，牽張組Ito峰值從+20 mV電壓開始顯著減小，且牽張組Ito的I-V曲線明顯下移，見圖2。在+60 mV鉗制電壓水平，對(duì)照組與牽張組電流密度分別為(12.1±2.9)pA/pF 和(1.6±0.4)pA/pF(P<0.01)。

Figure 2. Current density-voltage curve of Ito in neonatal rat atrial myocytes. Mean±SD.n=9. **P<0.01 vs control group.

3 牽張刺激對(duì)乳大鼠心房肌細(xì)胞IK1的影響

在-90 mV～-120 mV鉗制電壓水平，牽張組較對(duì)照組電流密度明顯增大，在-120 mV鉗制電壓水平，IK1幅度達(dá)到最大，此電壓下對(duì)照組與牽張組平均電流密度分別為(-8.8±0.9)pA/pF和(10.8±0.8)pA/pF(P<0.01)。圖3顯示IK1的內(nèi)向整流特性。

4 牽張對(duì)乳大鼠心房肌細(xì)胞AP的影響

與對(duì)照組相比,牽張組心房肌細(xì)胞RMP無明顯差異，APA降低，APD50和APD90縮短，動(dòng)作電位形態(tài)變窄,見圖4、表1。

討 論

房顫病因繁多，隨著基礎(chǔ)疾病導(dǎo)致心房壓力負(fù)荷不斷增大，心房肌受到牽張刺激隨之增大。壓力負(fù)荷促使心肌肥大[6]，增加基質(zhì)金屬蛋白酶活性[7]，離子通道相應(yīng)基因的表達(dá)也發(fā)生變化，心房發(fā)生重構(gòu)[6,8]。

Ito和IK1分別在AP 1期和3期復(fù)極中起著重要作用。房顫患者心房肌細(xì)胞Ito密度降低[9]，IK1密度增大[10]，APD縮短，這些改變正是心房重構(gòu)的電生理特點(diǎn)之一，也可能是促進(jìn)房顫發(fā)生和維持的機(jī)制之一[11]。本研究結(jié)果顯示，牽張組心房肌細(xì)胞Ito電流密度從+20 mV開始顯著減小，且與對(duì)照組相比Ito的I-V曲線明顯下移。與王德勝等[9]對(duì)房顫患者心房肌細(xì)胞研究不同的是，Ito電流密度在+20 mV～+60 mV顯著下降，而在較低電壓下對(duì)照組和牽張組相比電流密度無顯著差異。出現(xiàn)上述差異可能因Ito在不同種屬表達(dá)的差異性。另外，在-120 mV鉗制電壓水平，牽張刺激促進(jìn)IK1增大。

Figure 3. Current density-voltage curve of IK1 in neonatal rat atrial myocytes. Mean±SD.n=9. ** P<0.01 vs control group.

Figure 4. Action potential of neonatal rat atrial myocytes.A: a cell of control group; B: a cell of stretched group.

表1 2組動(dòng)作電位相關(guān)參數(shù)比較

AP產(chǎn)生的原因主要是由于細(xì)胞膜兩側(cè)帶電離子的不均衡分布，以及在不同情況下細(xì)胞膜對(duì)一些離子的通透性發(fā)生改變所致。因此，AP是由多種離子通道共同參與決定。本研究結(jié)果顯示牽張組APD50和APD90明顯縮短，APA降低，證實(shí)牽張刺激促進(jìn)心房肌細(xì)胞電重構(gòu)。包括心房肌細(xì)胞Ito和IK1在內(nèi)的多種離子通道電流發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞膜離子通透性變化，影響跨膜離子流，共同導(dǎo)致APD縮短和APA降低。

本研究通過細(xì)胞牽張模型，模擬心房負(fù)荷過重對(duì)心房產(chǎn)生的機(jī)械力學(xué)作用，反映心房負(fù)荷增加對(duì)細(xì)胞離子通道的影響，為心房電重構(gòu)和房顫疾病發(fā)生機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)研究依據(jù)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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