李曉燕， 劉金玲， 桂 樂， 朱健華

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 南通 226001)

慢性充血性心力衰竭(簡(jiǎn)稱慢性心衰,chronic heart failure,CHF)是多數(shù)心血管疾病的終末階段。多年來研究證實(shí)交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)是慢性心衰發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，過度的交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)對(duì)心臟本身和心功能均產(chǎn)生不利影響，這是慢性心力衰竭心功能惡化的主要原因。下丘腦室旁核(paraventricular nucleus, PVN)是神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)中樞，是調(diào)節(jié)細(xì)胞外液容量和交感神經(jīng)驅(qū)動(dòng)的關(guān)鍵腦區(qū)。大量研究發(fā)現(xiàn)存在于腦組織、外周神經(jīng)系統(tǒng)和心肌細(xì)胞中，具有高度的鉀離子選擇性、鈣離子高度敏感性和電壓不依賴性的下丘腦室旁核小電導(dǎo)鈣激活鉀通道(small-conductance calcium-activated potassium channels,SK通道)可引起神經(jīng)元的后超極化，對(duì)神經(jīng)的興奮節(jié)律和興奮模式起重要調(diào)控作用。體外實(shí)驗(yàn)[1-2]證明阻斷PVN內(nèi)SK通道，PVN頭端延髓腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateral medulla, RVLM)神經(jīng)興奮性明顯增加，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的興奮性。在體實(shí)驗(yàn)[3]證明在正常大鼠中阻斷下丘腦室旁核SK通道后，腎交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)以及平均動(dòng)脈壓升高。目前在心衰發(fā)病過程中SK通道對(duì)PVN神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)尚不清楚，我們推測(cè)在心衰發(fā)展過程中，PVN-RVLM神經(jīng)元中SK通道功能降低，可能增加神經(jīng)元的興奮性，進(jìn)而促進(jìn)交感神經(jīng)的興奮性增加。為了進(jìn)一步觀察SK通道在心衰中的作用，本研究制作大鼠慢性心力衰竭模型，構(gòu)建SK2基因過表達(dá)載體作用于下丘腦室旁核，觀察SK2的表達(dá)，記錄大鼠心率、血壓和腎交感神經(jīng)活性(renal sympathetic nerve activity,RSNA)的變化，探討心衰中SK通道與腎交感神經(jīng)活性的關(guān)系，研究慢性心衰的中樞調(diào)控機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與動(dòng)物

SK2 基因過表達(dá)的腺病毒載體rKCNN2重組腺病毒穿梭載體pDC316-mCMV-EGFP-rKCNN2(AD-rKCNN2, 1×1013pfu/L)和空白對(duì)照重組腺病毒穿梭載體pDC316-mCMV-EGFP(AD-EGFP, 1×1013pfu/L)由百恩維生物公司提供。兔抗SK2Ⅰ抗購自Alomone Lab；羊抗兔Ⅱ抗購自Santa Cruz。RNA抽提試劑盒(RNeasy Mini Kit)購自Qiagen。

8～12周齡、 體重(200±20) g的健康雄性SD大鼠由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。80只大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)對(duì)照組(sham-EGFP)、假手術(shù)SK2過表達(dá)組(sham-rKCNN2)、心衰對(duì)照組(CHF-EGFP)和心衰SK2過表達(dá)組(CHF-rKCNN2)。以結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支制造心衰大鼠模型[4]，假手術(shù)組同樣開胸打開心包, 但僅在相同部位穿線并不結(jié)扎, 術(shù)后肌肉注射2×105U青霉素鈉預(yù)防感染, 術(shù)后喂養(yǎng)6周后超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能變化，采用EF值<42%作為評(píng)定心力衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。

2 主要方法

2.1下丘腦室旁核腺病毒注射 術(shù)后6周4組大鼠均以10%水合氯醛1.5 mL/kg腹腔注射來實(shí)施麻醉，固定在腦立體定位儀上，沿矢狀縫做皮膚切口暴露顱骨，調(diào)整前囟和后囟至同一水平。 PVN位置：B=1.8 mm，L=0.4 mm，H=7.9 mm，B表示為前囟向后，L表示正中線左右旁開，H表示硬腦膜下深度。電鉆顱骨鉆孔，用微量注射器插入PVN內(nèi)，左右兩側(cè)分別注射100 nL AD-rKCNN2或AD-EGFP(由百恩維生物公司通過光鏡觀察對(duì)神經(jīng)沒有損傷，轉(zhuǎn)染效果良好)。

2.2AD-rKCNN2 病毒載體過表達(dá)效果的驗(yàn)證

2.2.1免疫組化染色 病毒注射后7 d，每組實(shí)驗(yàn)大鼠隨即抽取5只，麻醉大鼠后, 經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定, 取出腦組織經(jīng)12%～18%蔗糖脫水固定。取固定后腦組織，頭尾方向截取視交叉與乳頭體之間部分，在冰凍切片機(jī)上進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，切片厚度 15 μm。切片加3% H2O2室溫下孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3次×5 min，加SK2抗體孵育，PBS沖洗，每張切片加聚合物增強(qiáng)劑(polymer helper)，加抗兔聚合物(poly-HRP anti-mouse/rabbit IgG)，孵育沖洗，加DAB，室溫條件下顯色沖洗，蘇木素復(fù)染。脫水，透明，封片。所有切片采用雙盲法由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生閱片。隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

2.2.2組織提取 病毒注射后7 d，每組實(shí)驗(yàn)大鼠隨即抽取10只，大鼠斷頭，取腦，移至液氮，隨后儲(chǔ)存在-80 ℃的條件下，留作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)迅速從冰箱中取出冰凍的腦，用冰凍切片機(jī)切片。切片厚度：300 μm(60 μm×5)。在冰上操作，用穿孔器，根據(jù)大鼠腦定位圖譜(Watson & Paxinos)，在2 mm厚(距前囟點(diǎn)-0.84 ～-2.8 mm)的雙側(cè)腦片的PVN所在區(qū)域，打孔，提取PVN至Eppendorf 管中。

2.2.3Western blotting 取100～150 mg下丘腦室旁核組織, 加入1 mL RIPA， 10 μL苯甲基磺酰氟勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，以去除細(xì)胞碎片，收取上清液分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆谩CA法進(jìn)行蛋白定量后, 取總蛋白50 μg，與5×上樣緩沖液混合煮沸5 min，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白。電泳結(jié)束后, 蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉60 min, 加入SK2Ⅰ抗(1∶200)室溫振蕩孵育2 h，加入HRP標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗(1∶500)孵育1 h。然后, 經(jīng)顯色、曝光、掃描、Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行分析。

2.2.4RT-PCR 取100 mg室旁核組織，置于預(yù)冷的勻漿器中，加入1 mL Trizol冰上勻漿，將勻漿液室溫放置10 min后倒入1.5 mL EP管中12 000 r/min、4 ℃離心10 min。取上清，加0.2 mL氯仿，劇烈搖動(dòng)30 s，室溫3 min。12 000×g、4 ℃離心15 min。 吸上層無色水相轉(zhuǎn)移入另一EP管中(約0.5 mL)。加等體積異丙醇，混勻， 室溫 20 min，12 000×g、4 ℃離心10 min。棄上清，加75%乙醇1 mL，振蕩。12 000×g、4 ℃離心5 min去上清，用濾紙小心吸取殘留液體，室溫干燥5～10 min，加入30～50 μL DEPC水，充分溶解RNA，紫外分光光度計(jì)法測(cè)定RNA，將RNA溶液置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄提取cDNA。按照常規(guī)方法進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。SK2上游引物5’-ACCTGCACGAGATGGACTCA-3’，下游引物5’-TTGTGCTCCGGCTTAGACAC-3’片段大小為145 bp。按照94 ℃×3 min，94 ℃×30 s,-60 ℃×30 s,40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴(kuò)增完畢后取5 μL 產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶) 電泳, 攝像，分析。

2.3血壓、心率和腎交感神經(jīng)活性的測(cè)定 病毒注射后7 d，每組實(shí)驗(yàn)大鼠隨即抽取5只，2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉后, 將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上, 氣管插管, 分離頸外靜脈并插管，分離左側(cè)股動(dòng)脈并插管, 導(dǎo)管接壓力換能器, 與橋式放大器相連，PowerLab 8/30 SP系統(tǒng)采集信號(hào)，持續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓、平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure, MAP)和心率；然后動(dòng)物取俯臥位，利用門齒鉤、雙側(cè)耳棒將大鼠頭部固定于腦立體定向儀上，接著動(dòng)物取右側(cè)臥位, 經(jīng)腰部縱行切口沿腹膜后路徑暴露左側(cè)腎臟、腎動(dòng)脈和腎神經(jīng)，分離腎交感神經(jīng)，浸入溫石蠟油中，安放銀絲電極，接生物電放大器，PowerLab 8/30 SP系統(tǒng)采集信號(hào)。下丘腦室旁核注射SK2受體阻滯劑apamin(12.5 pmol/100 nL)，記錄心率、血壓和腎交感神經(jīng)活性。腎交感神經(jīng)放電對(duì)藥物的反應(yīng)以注藥前后實(shí)測(cè)值之差與注藥前相比的百分率表示，其中微量注射前取1 min腎交感神經(jīng)放電的平均值。微量注射后，在達(dá)到最大反應(yīng)后的1 min時(shí)間內(nèi)求RSNA反應(yīng)的平均值。腎交感神經(jīng)放電以實(shí)測(cè)值與噪聲值之差表示，噪聲值為股靜脈注射10%KCl后10 min的RSNA值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),室旁核內(nèi)微量注射2%滂胺天藍(lán)溶液50 nL, 靜脈注射10% KCl處死動(dòng)物剪取頭顱,去除顱骨，將腦組織固定于10%甲醛溶液中2 d后切片在顯微鏡下定位微量注射點(diǎn)位置，定位不準(zhǔn)確者不列入統(tǒng)計(jì)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠心功能評(píng)價(jià)

左冠脈結(jié)扎術(shù)后6周，超聲檢查可見手術(shù)組大鼠存在不同程度的心尖區(qū)或心前壁變薄，室壁運(yùn)動(dòng)減弱，左心內(nèi)徑擴(kuò)大，射血分?jǐn)?shù)(ejction fraction,EF)下降。表1顯示了假手術(shù)組與手術(shù)組的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)：CHF組左心室舒張期內(nèi)徑(left ventricular interior dimention,LVIDd)較sham組明顯增高，EF及短軸縮短率(fractional shortening, FS)較sham組明顯降低(P<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。這表明慢性心衰引起心室重構(gòu)和水鈉潴留。

表1 冠脈結(jié)扎術(shù)后6周大鼠心功能測(cè)量值的比較

室旁核微量注射AD-rKCNN2后7 d，心衰組左心室舒張期內(nèi)徑、射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率較注射前有好轉(zhuǎn)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 室旁核微量注射AD-rKCNN2后7 d心功能的測(cè)定

2 免疫組化檢測(cè)大鼠下丘腦室旁核SK2表達(dá)的變化

定位注射腺病毒后7 d，灌注處死大鼠取組織做冰凍切片行免疫組化，觀察大鼠下丘腦室旁核SK2表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)SK2陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿著棕黃色，心衰對(duì)照組(CHF-EGFP)的SK2陽性細(xì)胞較少且染色淺，明顯低于假手術(shù)對(duì)照組(sham-EGFP)，SK2 過表達(dá)組大鼠下丘腦室旁核SK2陽性細(xì)胞數(shù)量多且染色深，明顯多于心衰對(duì)照組，見圖1。

Figure 1. The expression of SK2 in the PVN (immunohistoche-mical staining,×200). Mean±SD. n=5. #P<0.05 vs sham-EGFP; *P<0.05 vs CHF-EGFP.

3 RT-PCR和Western blotting檢測(cè)下丘腦室旁核SK2 轉(zhuǎn)染及表達(dá)水平

腺病毒定位注射后 7 d，取大鼠下丘腦室旁核組織，利用 RT-PCR和Western blotting檢測(cè)SK2表達(dá)，心衰對(duì)照組SK2表達(dá)明顯低于假手術(shù)對(duì)照組，SK2過表達(dá)組明顯多于心衰對(duì)照組，見圖2。

4 微量注射SK2受體阻滯劑apamin后大鼠血壓、心率和腎交感神經(jīng)活性的比較

表3示SK2阻滯劑apamin注射后，CHF-EGFP組較sham-EGFP組的MAP和RSNA增幅降低(P<0.05)。給予AD-rKCNN2后，CHF-rKCNN2組較CHF-EGFP組MAP和RSNA增幅升高(P<0.05)。Sham-rKCNN2和sham-EGFP組對(duì)比RSNA無明顯變化。各組大鼠心率無明顯變化。

討 論

本實(shí)驗(yàn)主要發(fā)現(xiàn)心衰大鼠的SK2表達(dá)明顯少于假手術(shù)對(duì)照組，PVN微量注射AD-rKCNN2使心衰大鼠增高的腎交感神經(jīng)活性明顯降低，這個(gè)結(jié)果顯示下丘腦室旁核SK2在調(diào)節(jié)心衰大鼠腎交感神經(jīng)活性方面起重要作用。

Figure 2. The mRNA (A)and protein (B) expression of neuronal SK2 in the punched paraventricular nucleus (PVN) tissues measured by RT-PCR and Western blotting. Mean±SD. n=5. #P<0.05 vs sham-EGFP; *P<0.05 vs CHF-EGFP.

表3 微量注射SK2受體阻滯劑apamin后大鼠平均動(dòng)脈壓、心率和腎交感神經(jīng)活性改變的比較

*P<0.05vsCHF-EGFP;#P<0.05vssham-EGFP.

目前認(rèn)為SK通道至少有3種亞型: SK1(KCNN1)、SK2(KCNN2)和SK3(KCNN3)。在不同的組織細(xì)胞上各亞型表達(dá)存在差異，在神經(jīng)系統(tǒng)中主要為SK2和SK3亞型通道。SK的3個(gè)亞型對(duì)蜂毒明肽(apamin)的敏感性不同，其中SK1不能被apamin阻斷，而SK2能被apamin阻斷[6]。我們制作大鼠SK2過表達(dá)基因(AD-rKCNN2)用于本實(shí)驗(yàn)。

交感神經(jīng)過度激活是心力衰竭的主要病理特征，也是心力衰竭發(fā)病率和病死率不斷提高的主要原因，PVN是神經(jīng)活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)中樞，是調(diào)節(jié)交感神經(jīng)驅(qū)動(dòng)的關(guān)鍵腦區(qū)，可以通過改變外周交感神經(jīng)的傳出活動(dòng)發(fā)揮它對(duì)心血管功能的調(diào)節(jié)作用[7-9]。神經(jīng)元興奮性的重要決定因素是動(dòng)作電位后的后超極化，它影響神經(jīng)元的放電功能。SK通道通過介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞動(dòng)作電位的后超極化過程，調(diào)控神經(jīng)元的放電模式[2, 10]。我們的實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR 和 Western blotting得出心衰大鼠SK2 mRNA和蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低(P<0.05)，給予AD-rKCNN2后，SK2過表達(dá)組明顯高于心衰對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反映了SK2表達(dá)確實(shí)在心衰狀態(tài)下較假手術(shù)組減低。該結(jié)果提示心衰時(shí)PVN內(nèi)出現(xiàn)了SK通道蛋白的表達(dá)變化，SK通道亞型的表達(dá)受到抑制。有研究表明SK2過表達(dá)會(huì)引起后超極化電流顯著增強(qiáng)[11]，轉(zhuǎn)基因小鼠的小腦神經(jīng)核團(tuán)SK2下調(diào)可能通過使后超極化電流缺失而導(dǎo)致自主性放電及興奮性的增加[12]。因此我們推測(cè)SK介導(dǎo)中樞神經(jīng)元放電特性的調(diào)控功能在心衰時(shí)也會(huì)降低。上述研究證實(shí)了SK通道的表達(dá)變化可以影響其調(diào)控神經(jīng)元活性的功能。我們的研究表明SK2過表達(dá)治療使心衰大鼠增高的腎交感神經(jīng)活性明顯降低，推測(cè)其潛在的規(guī)律是心衰SK通道表達(dá)減少，則PVN神經(jīng)元自主性放電及興奮性增加，從而促使交感神經(jīng)沖動(dòng)由中樞向外周組織發(fā)放增加，并加重心衰的發(fā)生。SK通道表達(dá)增加，則PVN神經(jīng)元自主性放電及興奮性降低，可能改善心衰的進(jìn)展。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Chen QH, Andrade MA, Calderon AS, et al. Hypertension induced by angiotensin II and a high salt diet involves reduced SK current and increased excitability of RVLM projecting PVN neurons[J]. J Neurophysiol, 2010, 104(5): 2329-2337.

[2] Chen QH, Toney GM. Excitability of paraventricular nucleus neurons that project to the rostral ventrolateral medulla is regulated by small conductance Ca2+activated K+channels[ J]. J Physiol, 2009, 587(Pt 17):4235-4247.

[3] Gui L, LaGrange LP, Larson RA, et al. Role of small conductance calcium-activated potassium channels expressed in PVN in regulating sympathetic nerve activity and arterial blood pressure in rats[J]. Am J Physiol Re-gul Integr Comp Physiol, 2012, 303(3):R301-R310.

[4] Davidoff AW, Boyden PA, Schwartz K, et al. Congestive heart failure after myocardial infarction in the rat: cardiac force and spontaneous sarcomere activity[J]. Ann N Y Acad Sci, 2004, 1015:84-95.

[5] 朱文暉，張曉紅，肖淵茗. 超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心力衰竭大鼠模型心功能改變[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 34(5):453-456.

[6] Liegeois JF, Mercier F, Graulich A, et al. Modulation of small conductance calciuma-ctivated potassium (SK) channels: a new challenge in medicinal chemistry[J]. Curr Med Chem, 2003, 10(8):625-647.

[7] Ferguson AV, Latchford KJ, Samson WK. The paraventricular nucleus of the hypothalamus:a potential target for integrative treatment of autonomic dysfunction[J]. Expert Opin Ther Targets, 2008, 12(6):717-727.

[8] Chen QH, Toney GM. Identification and characterization of two functionally distinct groups of spinal cord-projecting paraventricular nucleus neurons with sympathetic-related activity[J]. Neuroscience, 2003, 118(3):797-807.

[9] Chen QH, Toney GM.Invivodischarge properties of hypothalamic paraventricular nucleus neurons with axonal projections to the rostral ventrolateral medulla[J]. J Neurophysiol, 2010, 103(1):4 -15.

[10] Bond CT, Maylie J, Adelman JP. SK channels in excitability,pacemaking and synaptic integration[J]. Curr Opin Neurobiol, 2005, 15(3):305-311.

[11] Miller MJ, Rauer H, Tomita H, et al. Nuclear localization and dominant-negative suppression by a mutant SKCa3 N-terminal channel fragment identified in a patient with schizophrenia[J]. J Biol Chem, 2001, 276(30):27753-27756.

[12] Shakkottai VG, Chou CH, Oddo S, et al. Enhanced neuronal excitability in the absence of neurodegeneration induces cerebellar ataxia[J]. J Clin Invest, 2004, 113(4):582-590.