李 麗， 劉文彥， 高 波

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，山東 日照 276826； 2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，山東 濟(jì)寧 272100)

中樞化學(xué)感受器位于延髓腹外側(cè)的淺表部位，當(dāng)其局部的細(xì)胞外液中或腦脊液中[H+]升高時(shí)，可使其受到刺激，并將信號(hào)傳至呼吸中樞引起呼吸加深加快的反應(yīng)。血液中的CO2能迅速透過(guò)血-腦脊液屏障，與腦脊液中的H2O在碳酸酐酶的作用下反應(yīng)生成H2CO3，然后解離出H+，間接刺激中樞化學(xué)感受器進(jìn)而引起呼吸興奮的效應(yīng)[1]。因此，中樞化學(xué)感受器能特異地感受[H+]的變化，進(jìn)而對(duì)呼吸產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用，但目前對(duì)于中樞化學(xué)感受器呼吸調(diào)節(jié)的機(jī)制尚不完全清楚。酸敏感離子通道(acid sensing ion channels, ASICs)是一類存在于細(xì)胞膜上的蛋白復(fù)合體，屬于非電壓門控的對(duì)Na+有高度通透性的離子通道，由細(xì)胞外酸化激活，可以特異地感受[H+]的變化，并在外周和中樞廣泛表達(dá)。ASIC1a是ASICs的一種亞型，當(dāng)pH值小于6.9時(shí)，ASIC1a即可被激活，并能被PcTx1特異性阻斷[2]。由此我們推測(cè)，ASICs尤其是ASIC1a可能在由中樞化學(xué)感受器介導(dǎo)的呼吸調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。因此，在本研究中，以膈肌肌電為指標(biāo)，通過(guò)腦室內(nèi)注射酸化人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid, aCSF)，觀察中樞化學(xué)感受器受到刺激時(shí)呼吸的變化；然后通過(guò)腦室內(nèi)注射ASICs的阻斷劑阿米洛利和ASIC1a特異性阻斷劑PcTx1，觀察阿米洛利和PcTx1對(duì)腦室內(nèi)注射酸化aCSF所致呼吸效應(yīng)的影響，以期探討ASICs在中樞化學(xué)感受器呼吸調(diào)節(jié)中的作用。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物與主要試劑

實(shí)驗(yàn)選用健康成年SD大鼠共30只，雌雄不限，體重250～300 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

阿米洛利(amiloride)購(gòu)自Sigma，PcTx1購(gòu)自Spider Pharm。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組 健康成年SD大鼠隨機(jī)分為6組，aCSF(pH 7.4)對(duì)照組(4只)、aCSF(pH 6.5)組(6只)、amiloride對(duì)照組(4只)、amiloride+aCSF(pH 6.5)組(6只)、PcTx1對(duì)照組(4只)及PcTx1+aCSF(pH 6.5)組(6只)。

2.2側(cè)腦室注射 所有動(dòng)物經(jīng)氨基甲酸乙酯(1 g/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，行頸部氣管插管，切斷雙側(cè)迷走神經(jīng)，一側(cè)股動(dòng)脈插管以監(jiān)測(cè)血壓，于劍突下打開(kāi)腹腔并暴露膈肌，并在膈肌上找到合適位置連接電極，以膈肌肌電記錄呼吸運(yùn)動(dòng)的變化。 然后以先固定雙耳、再固定門齒的順序?qū)⒋笫蠊潭ㄔ谀X立體定位儀中以保持大鼠頭位的水平。參照Paxinos和Watson的《鼠腦立體定位圖譜》，以Bregma點(diǎn)向后1.0 mm、中線旁開(kāi)1.5 mm處為穿刺點(diǎn)，通過(guò)微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)針3.5～4.0 mm向側(cè)腦室內(nèi)緩慢勻速注射藥物。aCSF(pH 7.4)對(duì)照組注射aCSF(pH 7.4) 10 μL；aCSF(pH 6.5)組注射aCSF(pH 6.5) 10 μL；amiloride對(duì)照組注射amiloride(10 mmol/L)10 μL；amiloride+aCSF (pH 6.5)組注射amiloride(10 mmol/L)10 μL后立刻注射aCSF(pH 6.5)10 μL；PcTx1對(duì)照組注射PcTx1(10 nmol/L)10 μL；PcTx1+aCSF(pH 6.5)組注射PcTx1(10 nmol/L)10 μL后立刻注射aCSF(pH 6.5)10 μL。

2.3觀察指標(biāo) 所有動(dòng)物在手術(shù)基本結(jié)束、微量進(jìn)樣器藥物注射前恢復(fù)30 min。自微量注射器注射藥物前 5 min、注射藥物即刻及注射藥物后每5 min監(jiān)測(cè)1次血壓和呼吸，每次監(jiān)測(cè)1 min，呼吸和血壓均經(jīng)BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行觀察和分析。股動(dòng)脈平均壓(mean blood pressure, MBP)以mmHg表示，膈肌肌電呼吸的變化以吸氣時(shí)程(inspiratory time, TI)、呼氣時(shí)程(expiratory time, TE)、呼吸頻率(respiratory frequency, RF)和吸氣幅度(amplitude of inspiration, Amp)為指標(biāo)進(jìn)行觀察。

2.4注射部位鑒定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，向腦室內(nèi)注入20 g/L美藍(lán)溶液0.5 μL并處死動(dòng)物開(kāi)顱取腦，100 mL/L甲醛固定24 h，切開(kāi)鑒定藥物注射部位，凡未注入側(cè)腦室的動(dòng)物結(jié)果棄去。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS分析軟件，通過(guò)兩均數(shù)比較t檢驗(yàn),對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

所有動(dòng)物在注射藥物前后血壓無(wú)顯著變化(P>0.05)，見(jiàn)表1。aCSF(pH 7.4)對(duì)照組動(dòng)物、amiloride對(duì)照組動(dòng)物及PcTx1對(duì)照組動(dòng)物藥物注射前后呼吸無(wú)明顯變化(P>0.05)；aCSF(pH 6.5)組及PcTx1+aCSF(pH 6.5)組動(dòng)物，藥物注射時(shí)呼吸無(wú)明顯變化，藥物注射5 mim后開(kāi)始出現(xiàn)呼吸興奮，但尚未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，藥物注射10 min后呼吸明顯興奮(P<0.05)，藥物注射15 min呼吸興奮程度明顯減弱，與注射藥物前無(wú)顯著差異(P>0.05)，藥物注射后20 min呼吸基本恢復(fù)正常；amiloride+aCSF(pH 6.5)組動(dòng)物藥物注射前后無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表1、圖1。aCSF(pH 6.5)組動(dòng)物及PcTx1+aCSF(pH 6.5)組動(dòng)物在藥物注射后10 min，計(jì)算其TI、TE、RF、Amp的變化率(injection 10-pre-injection)/pre-injection×100%，結(jié)果顯示PcTx1+aCSF(pH 6.5)組的動(dòng)物以上數(shù)據(jù)的變化率明顯低于aCSF(pH 6.5)組的動(dòng)物，即藥物注射10 min后呼吸興奮程度明顯低于aCSF(pH 6.5)組動(dòng)物(P<0.05)，見(jiàn)表2。

Figure 1. The effect of amioride and PcTx1 on the respiratory reactions induced by intracerebroventricular injection of aCSF (pH 6.5) in the rats. A: injection of aCSF (pH 6.5); B: injection of PcTx1 plus aCSF (pH 6.5); C: injection of amiloride plus aCSF (pH 6.5).

表1 Amiloride和PcTx1 對(duì)腦室內(nèi)注射aCSF(pH 6.5)所致的呼吸效應(yīng)和股動(dòng)脈平均壓的影響

表2 PcTx1對(duì)腦室內(nèi)注射aCSF(pH 6.5)引起呼吸效應(yīng)變化的影響

討 論

1 腦室內(nèi)注射aCSF(pH 6.5)對(duì)呼吸的影響

在本研究中，腦室內(nèi)注射aCSF(pH 6.5)后10 min TI、TE明顯縮短，RF明顯增快，Amp明顯增大，即呼吸出現(xiàn)明顯興奮，而腦室內(nèi)注射aCSF(pH 7.4)后呼吸沒(méi)有明顯變化，提示呼吸興奮的出現(xiàn)是腦室內(nèi)注射酸化aCSF所致。腦室內(nèi)注射aCSF(pH 6.5)后造成腦脊液中[H+]升高，可直接刺激位于延髓腹外側(cè)淺表部位中樞化學(xué)感受器頭端區(qū)和尾端區(qū)的化學(xué)敏感神經(jīng)元，并將此信號(hào)傳至腦干呼吸中樞，引起呼吸興奮[3]。近年來(lái)的研究表明，斜方體后核、孤束核、藍(lán)斑及下丘腦等部位也存在化學(xué)敏感神經(jīng)元，當(dāng)它們受到酸化刺激時(shí)也會(huì)引起呼吸興奮[4]。

2 Amiloride對(duì)腦室內(nèi)注射aCSF(pH 6.5)引起的呼吸效應(yīng)的影響

ASICs屬于非電壓門控的對(duì)Na+有通透性的離子通道，由細(xì)胞外酸化激活，在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)。目前的研究表明，ASICs有ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3及ASIC46種亞型，在外周與觸覺(jué)、酸味覺(jué)、視覺(jué)及傷害性刺激的感知有關(guān)，在中樞與腦組織缺血缺氧、癲癇等病理過(guò)程有關(guān)。6種亞型都可被阿米洛利阻斷[5]。在本研究中，腦室內(nèi)先注射amiloride，隨后注射aCSF(pH 6.5)，呼吸并未表現(xiàn)出明顯的興奮，而腦室內(nèi)單獨(dú)注射amiloride，呼吸也未出現(xiàn)明顯的變化，提示amiloride對(duì)正常呼吸不存在明顯的影響，但能阻斷腦脊液酸化后引起的呼吸興奮效應(yīng)。這與宋娜娜[6]在中樞化學(xué)感受器-延髓腹外側(cè)淺表部位微量注射amiloride 后注射酸化aCSF引起的呼吸效應(yīng)基本一致。由此可知，ASICs是參與中樞化學(xué)感受器呼吸調(diào)節(jié)的關(guān)鍵通道，但究竟是ASICs哪一種亞型在此過(guò)程中起主要作用，還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

3 PcTx1對(duì)腦室內(nèi)注射aCSF (pH 6.5)引起的呼吸效應(yīng)的影響

ASIC1a是ASICs的一種亞型，當(dāng)細(xì)胞外液pH值小于6.9時(shí)即可被激活，隨即引發(fā)快速激活及快速失活的電流，主要通透鈉離子，在腦及感覺(jué)神經(jīng)元廣泛表達(dá)。PcTx1最初是從一種南美洲狼蛛千里達(dá)老虎尾的毒腺中提取的毒素，能特異性阻斷ASIC1a[7]。在本研究中，腦室內(nèi)注射PcTx1，隨后注射aCSF(pH 6.5)，呼吸興奮程度較單獨(dú)注射aCSF(pH 6.5)明顯減弱，而腦室內(nèi)單獨(dú)注射PcTx1呼吸沒(méi)有出現(xiàn)明顯的變化，提示ASIC1a在腦室內(nèi)注射aCSF(pH 6.5)引起的呼吸效應(yīng)中發(fā)揮了部分作用。

綜上所述，腦室內(nèi)注射酸化aCSF能刺激中樞化學(xué)感受器引起呼吸興奮，ASICs是參與此過(guò)程的關(guān)鍵離子通道，而ASIC1a在此過(guò)程只發(fā)揮了部分作用，推測(cè)ASICs其它的亞型也參與了此過(guò)程。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] 鄭 煜. 呼吸[M]∥朱大年.生理學(xué). 第8版. 北京： 人民衛(wèi)生出版社，2013：177-185.

[2] 李 麗. 酸敏感的離子通道研究簡(jiǎn)介[J]. 中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志, 2010, 16(1):79-82.

[3] Guyenet PG, Abbott SB. Chemoreception and asphyxia-induced arousal[J]. Respir Physiol Neurobiol, 2013, 188(3):333-343.

[4] Guyenet PG, Abbott SB, Stornetta RL. The respiratory chemoreception conundrum: light at the end of the tunnel[J]. Brain Res, 2013, 1511:126-137.

[5] Benarroch EE. Acid-sensing cation channels: structure, function, and pathophysiologic implications[J]. Neurology, 2014, 82(7):628-635.

[6] 宋娜娜.中樞酸敏感離子通道對(duì)呼吸的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究[D].上海： 復(fù)旦大學(xué),2010.

[7] Diochot S1, Salinas M, Baron A, et al. Peptides inhibitors of acid-sensing ion channels[J]. Toxicon, 2007, 49(2):271-284.