朱廣平 徐曉玲

摘要：目的 探討黃芩抑菌作用對(duì)制劑微生物限度檢查方法的影響，同時(shí)建立平哮合劑微生物限度與控制菌的檢查方法。方法 采用常規(guī)法對(duì)中藥制劑進(jìn)行微生物限度方法驗(yàn)證，采用直接接種法進(jìn)行控制菌方法驗(yàn)證。結(jié)論 黃芩的抑菌作用對(duì)制劑微生物限度檢查的影響與制劑中黃芩的濃度有關(guān)，平哮合劑通過(guò)試驗(yàn)未見(jiàn)影響。結(jié)果 平哮合劑可用常規(guī)法進(jìn)行微生物檢驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：黃芩；微生物限度方法驗(yàn)證；平哮合劑1儀器和材料

1.1 儀器

DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱和MJX-150霉菌培養(yǎng)箱（上海申賢儀器設(shè)備廠）、YXQ.SG41.280手提式消毒鍋（上海醫(yī)用核子儀器有限公司），100級(jí)潔凈工作臺(tái)。

1.2 試劑

培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、MUG、培養(yǎng)基ｐＨ７．０無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液。上述除供試品外均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)，適應(yīng)性檢查均符合２０１０年版《中國(guó)藥典》一部附錄要求，可用于微生物限度檢查。供試品平哮合劑 (批號(hào)：130527)，江蘇省中醫(yī)院配制。菌株：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌驗(yàn)證、黑曲霉，以上由南京市藥檢所提供，實(shí)驗(yàn)所用的菌株均為第3代。

2方法和結(jié)果

2.1 供試液制備

吸取供試品10ml，加入pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 ml，搖勻，作為1:10供試液。

2.2 菌液制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于23～28℃培養(yǎng)24~48小時(shí)，上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至相應(yīng)濃度制成每1ml含菌數(shù)為30～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5~7天，加入3~5ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的孢子懸液。

2.3 微生物限度方法驗(yàn)證

2.3.1 試驗(yàn)組

按照２０１０年版《中國(guó)藥典》一部附錄要求，取供試液１ml，分別加入試驗(yàn)菌液１ml，立即傾注１５ml相應(yīng)培養(yǎng)基，平行制備２個(gè)平皿，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)３ｄ，霉菌培養(yǎng)５ｄ，觀察結(jié)果，記錄菌落數(shù)。

2.3.2 菌液組

按照２０１０年版《中國(guó)藥典》一部附錄要求，每平皿分別加入試驗(yàn)菌液1ml，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基15ml相應(yīng)培養(yǎng)基，待凝固后相應(yīng)溫度條件下倒培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。

2.3.3 供試品對(duì)照組

按照２０１０年版《中國(guó)藥典》一部附錄要求，取供試液1ml，平行制備2個(gè)平皿，立即傾注相應(yīng)培養(yǎng)基15ml，凝固后于相應(yīng)溫度條件下培養(yǎng)，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

根據(jù)下式計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表１。

回收率（％）＝（實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)－供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）／菌液組平均菌落數(shù)×１００％。

每種試驗(yàn)菌進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收。

2.3.4 回收率驗(yàn)證結(jié)果

回收率均高于70%。

2.4 控制菌驗(yàn)證方法

1ml大腸埃希菌（含菌數(shù)為10～100cfu），加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，經(jīng)35~37℃培養(yǎng)24小時(shí)。

2.4.1 試驗(yàn)組

取供試液10ml及10-100cfu的大腸埃希菌液加入100ml膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中檢查，35℃-37℃培養(yǎng)18h-24h，取上述增菌液0.2ml加入5mlMUG試管中，置35℃-37℃培養(yǎng)5h-24h，觀察熒光，再加入靛基質(zhì)試劑觀察結(jié)果。

2.4.2 供試品組

與試驗(yàn)組同法，不加陽(yáng)性菌液

2.4.3 陰性組

取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml，加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，后面與供試品組同法操作。

2.4.4 空白組

取100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基，經(jīng)35~37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，后面同前。

2.4.5 控制菌驗(yàn)證結(jié)果

3討論

制劑對(duì)微生物限度檢驗(yàn)時(shí)抑菌作用的產(chǎn)生，與制劑中的中藥材品種以及該品種的濃度有關(guān)，平哮合劑中黃芩的生藥濃度為0.05g/ml，因?yàn)闈舛容^低，其抑菌作用未對(duì)微生物檢驗(yàn)方法產(chǎn)生影響，可以用常規(guī)法檢驗(yàn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]趙敏,譚鋼文,唐小異,等．十種中藥提取物與抗生素合用對(duì)銅綠假單胞菌最小抑菌濃度影響的體外實(shí)驗(yàn)[J]．湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)報(bào))，2011，8(4):80-82．

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)．中國(guó)藥典2010年版[S]．一部．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄79-88．