付政祺， 鎮(zhèn)鴻燕， 劉麗江△

(江漢大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室, 2江大病理診斷所， 湖北 武漢 430056)

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78，GRP78), 又稱免疫球蛋白結(jié)合蛋白(immunoglobulin binding protein，BiP)，是參與蛋白質(zhì)折疊和組裝的重要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶[1]。正常(非應(yīng)激)狀態(tài)下，GRP78與橫跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白(PERK、IRE-1、ATF6)相結(jié)合，抑制其活性。當(dāng)各種因素，如細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、蛋白質(zhì)翻譯后修飾障礙、鈣平衡失調(diào)、病毒感染以及氧化應(yīng)激等，所致的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生紊亂時(shí)，GRP78與跨膜蛋白相解離，通過(guò)與未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白相結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊能力及其阻止錯(cuò)誤折疊/未折疊蛋白的釋出，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[2]。最近發(fā)現(xiàn)：GRP78在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[3-4]。

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率居惡性腫瘤的第二位[5]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于非腫瘤黏膜，人體胃癌組織細(xì)胞胞漿中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78和GRP94(與GRP78同屬熱休克蛋白70家族成員)的表達(dá)明顯升高，且與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)[6-7]。在胃癌裸鼠移植瘤模型中，敲除GRP78可抑制體外腫瘤細(xì)胞的侵襲力，及移植瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[8]，提示GRP78可能是促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、存活及轉(zhuǎn)移的重要分子。為進(jìn)一步明確GRP78在胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用，本研究對(duì)人胃癌組織中GRP78的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè), 觀察其與臨床病理參數(shù)(胃癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度等)的關(guān)系; 其次, 通過(guò)建立過(guò)表達(dá)GRP78的重組胃癌細(xì)胞模型SGC7901-H78，觀察生長(zhǎng)相關(guān)蛋白cyclin D1表達(dá)量的改變，以進(jìn)一步明確GRP78在胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集江漢大學(xué)附屬醫(yī)院2009～2010年胃腺癌根治性手術(shù)切除并有完整病理學(xué)檢查數(shù)據(jù)的標(biāo)本34例，及癌旁組織(腫瘤旁1 cm處)和正常組織(遠(yuǎn)離腫瘤≥10 cm處)34例。所有病例術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療。

1.2細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞株SGC7901由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系惠贈(zèng)，穩(wěn)定高表達(dá)GRP78細(xì)胞株由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建與鑒定。

1.3主要試劑 小牛血清購(gòu)自Gibco；GRP78抗體購(gòu)自Abcam；cyclin D1和β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz；BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自Pierce；SP試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞株SGC7901和SGC7901-H78(過(guò)表達(dá)GRP78的SGC7901)用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco), 置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次。

2.2免疫組織化學(xué)染色[7]所有染色均經(jīng)DAB顯色。 GRP78檢測(cè)以癌組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色表達(dá)為陽(yáng)性。 操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求進(jìn)行。

2.3Western blotting檢測(cè)[9]將胃癌組織、癌旁組織、正常組織勻漿收集，SGC7901細(xì)胞和SGC7901-H78細(xì)胞收集后，BCA法測(cè)蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜, 含5%脫脂奶粉的TBS-T(含0.05% Tween-20的TBS)37 ℃封閉60 min, 加1∶1 000稀釋的抗GRP78和抗cyclin D1蛋白的多克隆抗體4 ℃孵育過(guò)夜。 TBS-T漂洗5 min×3次, 加入1∶4 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG， 37 ℃孵育45 min。 TBS-T漂洗5 min×3次, ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理, 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，相關(guān)因素分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胃癌組織中GRP78的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn), GRP78在人體胃癌組織細(xì)胞的胞漿中高表達(dá), GRP78陽(yáng)性率為73.5% (25/34)，見(jiàn)圖1和表1。 Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 人體胃癌組織中GRP78的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(腫瘤旁1 cm范圍內(nèi))和正常組織，見(jiàn)圖2。

Figure 1. Immunohistochemical staining of GRP78 in gastric cancer tissues (×400). A: adjacent non-malignant tissues; B: high differentiation; C: intermediate differentiation; D: low differentiation.

2 胃癌組織中GRP78的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

全組34例胃癌, 男26例, 女8例。 年齡42～69歲, 中位年齡56.7歲。 免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 人體胃癌組織中GRP78表達(dá)水平明顯高于癌旁組織和正常組織，且與性別、分化程度相關(guān)，見(jiàn)圖1和表1。

表1 胃癌組織中GRP78的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

Figure 2. Western blotting analysis of GRP78 expression in specimens of gastric adenocarcinoma tumour tissues (T), adjacent non-malignant tissues (A) and corresponding normal tissues (N).

3 人胃癌細(xì)胞SGC7901和SGC7901-H78中GRP78和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白cyclin D1的表達(dá)改變

Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 相對(duì)于SGC7901細(xì)胞，SGC7901-H78細(xì)胞(穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GRP78的SGC7901)中GRP78蛋白的表達(dá)明顯升高；同時(shí)檢測(cè)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白cyclin D1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，隨著GRP78表達(dá)的上調(diào)，cyclin D1蛋白表達(dá)增加，見(jiàn)圖3。

Figure 3. Western blotting analysis of GRP78 and cyclin D1 expression in gastric cancer SGC7901 cells and SGC7901-H78 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs SGC7901.

討 論

GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的重要分子伴侶，參與蛋白質(zhì)的折疊、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)等[1]。雖然在主要的成熟器官中GRP78的表達(dá)都維持在低基礎(chǔ)水平，但在多種惡性腫瘤，如乳腺癌、胃癌、肺癌等中，GRP78的表達(dá)明顯上調(diào)，并隨著惡性程度的升高而升高[4, 7]。在轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞株和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中GRP78表達(dá)增高，而敲除 GRP78可抑制體外瘤細(xì)胞侵襲力，并且可抑制異種移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境下，GRP78的高表達(dá)可以減少腫瘤細(xì)胞的凋亡，有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[10-11]。

本研究在人體胃癌組織中發(fā)現(xiàn)GRP78的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織和正常組織(陽(yáng)性率為73.5%)，且與性別、分化程度相關(guān)。其結(jié)果進(jìn)一步提示GRP78是參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的重要分子。為了進(jìn)一步證實(shí)GRP78在促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用，本研究檢測(cè)胃癌細(xì)胞SGC7901和過(guò)表達(dá)GRP78的SGC7901-H78細(xì)胞中，生長(zhǎng)相關(guān)蛋白cyclin D1的表達(dá)變化情況。

Cyclin D1是細(xì)胞周期中短暫出現(xiàn)的基因表達(dá)產(chǎn)物，與特定的周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)結(jié)合構(gòu)成復(fù)合體，可在G1/S 交界處將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與細(xì)胞周期調(diào)控聯(lián)系起來(lái)，而后降解[12]。研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤發(fā)生時(shí)，cyclin D1蛋白過(guò)表達(dá)，G1期縮短，對(duì)生長(zhǎng)因子的依賴性減少。由此，cyclin D1被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要分子[13-14]。在乳腺癌裸鼠移植瘤模型中，敲除cyclin D1b可抑制移植瘤的生長(zhǎng)，下調(diào)cyclin D1b可促進(jìn)阿霉素所致的細(xì)胞死亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在SGC7901-H78細(xì)胞中，隨著GRP78表達(dá)的上調(diào)，cyclin D1蛋白表達(dá)增加，進(jìn)一步證實(shí)GRP78是促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要分子。而GRP78影響cyclin D1蛋白表達(dá)，調(diào)控胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述， GRP78在人體胃癌組織中高表達(dá)，且與性別、分化程度相關(guān)。檢測(cè)胃癌細(xì)胞SGC7901和SGC7901-H78(過(guò)表達(dá)GRP78)中生長(zhǎng)相關(guān)蛋白cyclin D1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，隨著GRP78表達(dá)的上調(diào)，cyclin D1蛋白表達(dá)增加。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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