周開宇， 毛天明， 陳 茜， 羅永康

(臺州學院醫(yī)學院附屬臺州市立醫(yī)院，復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院臺州分院神經(jīng)外科, 浙江 臺州318000)

髓母細胞瘤是一種高度惡性呈浸潤性生長的顱內(nèi)腫瘤，好發(fā)于兒童，偶見于成年，目前以顯微手術(shù)切除為主輔以放療、化療等綜合治療[1]；但3歲以下兒童患者放療會嚴重影響發(fā)育，化療毒副作用比較嚴重，仍有30%～50% 的患兒治療效果極差，預(yù)后非常不良[2]。因此尋找一種對人髓母細胞瘤有效的抗瘤藥物，有重要的現(xiàn)實意義。

惡性腫瘤的生長、發(fā)展與細胞凋亡密切相關(guān)，抗腫瘤藥物誘導腫瘤細胞的凋亡是對腫瘤細胞作用的主要方面?？鄥A是苦參、苦豆子、廣豆根等豆科槐屬植物中生物堿的主要成分，具有良好的藥理活性，能利尿解毒、清熱利濕、退黃降酶、抗心律失常等作用，且無明顯的毒副作用。近期的研究表明，苦參堿具有抗腫瘤的效應(yīng)，能抑制膽囊癌、前列腺癌等惡性腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的凋亡[3-4]。但是對于苦參堿作用于人髓母細胞瘤細胞的研究卻少有報道，目前也不清楚苦參堿是否會抑制該瘤細胞的增殖，以及分子作用機制。因此本研究主要通過體外實驗來研究苦參堿對人髓母細胞瘤D341細胞的誘導凋亡作用，并探討相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt和磷酸化Akt(phosphorylated Akt, p-Akt)在苦參堿作用下表達的改變，為人髓母細胞瘤的發(fā)病及藥物治療提供重要的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

本研究中苦參堿由寧波天衡制藥有限公司提供，規(guī)格為 50 mg∶5 L。 D341細胞株由北京協(xié)和醫(yī)院細胞庫提供，Bax、 Bcl-2、Akt、p-Akt抗體、CCK-8和Annexin V-FITC試劑盒均由上海藍基生物科技有限公司提供，透射電子顯微鏡(JEM-1011)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 將D341細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，并于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2～3 d換1次液、每7 d左右傳代1次。

2.2CCK-8法檢測細胞增殖 將細胞消化、計數(shù)、配制成濃度為5×107cells/L的細胞懸液，96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細胞懸液；將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用培養(yǎng)基稀釋苦參堿至所需濃度(0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L和2.0 g/L)，每孔加入200 μL相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組；再將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h；向每孔中加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h；搖床10 min輕輕混勻；酶標儀在波長450 nm讀出每孔的吸光度(A)，計算抑制率。

2.3細胞超微結(jié)構(gòu)觀察 將經(jīng)體外培養(yǎng)的D341細胞分為實驗組和對照組。其中實驗組加入苦參堿濃度為2.0 g/L，對照組不加苦參堿?？鄥A作用24、48和72 h后分別離心(1 000 r/min，5 min)收集細胞，冷PBS洗滌2次；2.5%戊二醛固定48 h、1%餓酸再固定90 min，乙醇-丙酮梯度脫水，包埋，烘箱內(nèi)固化，切片，透射電鏡下觀察。

2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 將對數(shù)生長期的細胞消化接種到6孔板中，次日，根據(jù)組別設(shè)置加入用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度(0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L和2.0 g/L)，同時設(shè)立陰性對照組；藥物作用24 h、48 h和72 h后，消化收集細胞；用PBS洗滌細胞2次(2 000 r/min離心5 min)收集5×105細胞；加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞；然后再加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；用流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡情況。

2.5Western blotting檢測瘤細胞Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt蛋白的表達 取對數(shù)生長期的D341細胞接種于24孔板中，每孔200 μL，細胞密度為2×108/L，待細胞貼壁生長后實驗進行分4組?？鄥A組：加入苦參堿濃度分別為0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L和2.0 g/L；對照組除不加苦參堿，其余條件完全一致。各組分別再培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，收集各組細胞。加入100 mL預(yù)冷的細胞裂解液，冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白，以BCA法進行蛋白濃度的定量測定。常規(guī)制膠、上樣，蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)膜，封閉。用Ⅰ抗稀釋液 4 ℃孵育過夜：Bax (1∶5 000)、Bcl-2 (1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶500)和β-actin(鼠抗1∶1 000)。TBST洗膜 3次, 每次10 min。將膜與HRP結(jié)合的Ⅱ抗(辣根過氧化酶標記羊抗兔；1∶5 000)室溫下?lián)u蕩孵育2 h， TBST充分洗膜，漂洗3次，每次10 min?；瘜W發(fā)光顯色，暗盒中曝光，再顯影和定影，應(yīng)用凝膠掃描儀對膠片進行光密度掃描，并以β-actin為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 苦參堿對D341細胞增殖的抑制作用

CCK-8法顯示，在同一作用時間下，不同濃度的苦參堿對D341細胞增殖的抑制程度不同，單因素方差分析顯示任意兩組間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，在此次檢測的范圍內(nèi)，相同作用時間下D341細胞的增殖抑制率隨藥物濃度的增加而逐漸升高，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；同一濃度的苦參堿對D341細胞增殖的抑制程度隨著作用時間延長而增強，特別是苦參堿濃度在1.5 g/L和2.0 g/L時，其作用更明顯,見圖1。

2 苦參堿對D341細胞作用下細胞超微結(jié)構(gòu)的觀察

苦參堿(2.0 g/L)作用于人髓母細胞瘤細胞24 h、48 h和72 h后，在透射電鏡下觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果顯示，苦參堿誘導后細胞凋亡變化明顯，隨著誘導時間增加，染色質(zhì)趨邊固縮，胞漿中空泡增多、變大，并且出現(xiàn)凋亡小體。陰性對照組細胞核及染色質(zhì)分布正常，見圖2。

Figure 1. Inhibitory effect of matrine on the proliferation of D341 cells. Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs 72 h; △△P<0.01 vs 0.5, 1.0 or 1.5 g/L matrine.

Figure 2. Cell ultrastructure observation under transmission electron microscope.

3 苦參堿對D341細胞的凋亡作用

苦參堿作用于D341細胞24 h、48 h和72 h后，對照組及各實驗組細胞的凋亡率見圖3。用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測：正常細胞(FITC-，PI-)在流式細胞分析圖上為LL區(qū)；早期凋亡細胞(FITC+，PI-)在流式細胞分析圖上為LR區(qū)；后期凋亡細胞(FITC+，PI+)在流式細胞分析圖上為UR區(qū)?？鄥A能夠明顯誘導D341細胞凋亡，且隨著苦參堿濃度的增加，D341細胞的凋亡率逐漸升高。方差分析顯示，不同濃度的苦參堿作用下與陰性對照組間凋亡率的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

4 Bax、Bcl-2、Akt和 p-Akt表達水平的變化

不同濃度的苦參堿對D341細胞作用24 h、48 h和72 h后，隨著藥物濃度的增加，D341細胞Bax的表達逐漸增強，Bcl-2和p-Akt的表達逐漸下降，見圖4。

討 論

《神農(nóng)本草經(jīng)》曾注釋：苦參，味苦寒，主心腹結(jié)氣、瘕、積聚、黃疸?？鄥A是苦參、苦豆子、廣豆根等豆科槐屬植物中生物堿的主要成分，屬于四環(huán)的喹嗪啶類，其化學式為C15H24N20，分子骨架可看作2個喹嗪啶環(huán)的雜體。近期的研究結(jié)果表明[5-6]：苦參堿對腫瘤的防治有很大的作用，它是一種很有前途具有抗腫瘤作用的藥物。

在苦參堿眾多的抗腫瘤活性功能中，抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡的功能成為近年來各學者報道的熱點。Yu等[7]提出,苦參堿能抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，且與劑量呈量效關(guān)系，苦參堿誘導細胞凋亡和抑制自噬保護機制可能是苦參堿抗腫瘤潛力的一個主要方面。Shao等[8]發(fā)現(xiàn),苦參堿能有效抑制乳腺癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡，可作為一種很有發(fā)展前景的抗乳腺癌藥物。Liang等[9]在人骨肉瘤細胞的體內(nèi)或體外實驗研究中指出：苦參堿的增殖抑制和促進凋亡作用，主要是通過藥物上調(diào)瘤細胞Bax的表達，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達而起作用。關(guān)于苦參堿對人髓母細胞瘤細胞的抑制增殖、促進凋亡作用目前鮮有報道。本實驗的結(jié)果顯示，在同一作用時間下，不同濃度的苦參堿對D341細胞增殖的抑制程度不同，相同作用時間下增殖抑制率隨藥物濃度的增加而逐漸升高，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；同一濃度的苦參堿對D341細胞增殖的抑制程度隨著作用時間延長而增強，特別是苦參堿濃度比較高時，其作用更明顯；苦參堿能夠明顯誘導D341細胞凋亡，且隨著苦參堿濃度的增加，D341細胞的凋亡率逐漸升高。D341細胞經(jīng)苦參堿作用后，細胞染色質(zhì)趨邊固縮，胞漿中空泡增多、變大，并且出現(xiàn)凋亡小體。這些均與文獻報道相一致[10-11]。

Figure 3. D341 cell apoptosis analysis detected by flow cytometry with matrine treatment for 24 h and apoptotic rates of D341 cells during 24, 48 and 72 h. Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs negative control.

本實驗研究了D341細胞在苦參堿作用下，凋亡相關(guān)蛋白如Bax和Bcl-2基因表達水平的變化。隨著藥物濃度的增加或者作用時間的延長，D341細胞Bax的表達逐漸增強，Bcl-2的表達逐漸下降。Bcl-2蛋白家族在誘導凋亡的線粒體信號傳導途徑中起著重要的作用，它主要抑制細胞的凋亡，在腫瘤細胞中呈高表達[12]。體外研究中發(fā)現(xiàn)高表達Bcl-2能抑制放療或化療誘導腫瘤細胞凋亡，是放化療失敗的主要原因[13]。細胞在凋亡過程中主要表現(xiàn)為Bcl-2蛋白表達減少，Bax蛋白表達增加，Bcl-2/Bax比例下降，Bcl-2與Bax的異源二聚體減少，Bax同源二聚體增多[14]。目前認為[15]，Bcl-2抑制細胞凋亡的機制可能與凋亡促進蛋白Bax拮抗，抑制細胞色素C自線粒體釋放到胞質(zhì)，阻止細胞色素C對caspase蛋白酶激活。Bcl-2還能促進谷胱甘肽進入細胞核，從而改變核內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，阻止caspase蛋白酶的活動和其它核改變，抑制細胞凋亡發(fā)生。本研究認為苦參堿正是通過調(diào)控Bcl-2與Bax的表達而誘導人髓母細胞瘤細胞凋亡、分化，抑制腫瘤細胞的增殖。

本實驗進一步研究了D341細胞在苦參堿作用下，瘤細胞PI3K/Akt信號途徑的變化，苦參堿作用48 h后，隨著藥物濃度的增加， p-Akt的表達水平顯著降低。PI3K是一種細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，PI3K介導的信號轉(zhuǎn)導通路可以通過不同的方式調(diào)節(jié)細胞的分裂、分化、凋亡等活動[16]。蛋白激酶Akt是PI3K信號轉(zhuǎn)導途徑重要的信號分子，其可被PI3K激活成為具有磷酸激酶活性的p-Akt，p-Akt 可以增加NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，增加腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。PI3K/Akt信號途徑的活化，即p-AKT一方面可以激活或抑制其多種下游靶蛋白，如可抑制促凋亡蛋白Bad的激活以及caspase激酶的活化, 增加轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性以及上調(diào)凋亡拮抗蛋白Bcl-2的表達水平，另一方面可誘發(fā)下游一系列底物改變，誘導細胞死亡信號通路酶caspase-9的前體第196位Ser磷酸化，阻止caspase-9 對Apaf-1的結(jié)合與活化作用，使其失活，從而阻斷內(nèi)源性凋亡途徑[18]。有文獻報道[19]，在多種白血病細胞中均有PI3K/Akt 信號途徑的活化，而且PI3K/Akt的活性與白血病患者的化療效果、臨床預(yù)后等多種指標有關(guān)。我們的研究結(jié)果提示，苦參堿作用D341細胞，可能通過抑制PI3K/Akt的信號途徑的活化，誘導細胞發(fā)生凋亡。

Figure 4. Analysis of Bax, Bcl-2, Akt, p-Akt expression by Western blotting. 1: negative control; 2: matrine 0.5 g/L; 3: matrine 1.0 g/L; 4: matrine 1.5 g/L; 5: matrine 2.0 g/L.Mean±SD.n=3.

因此，深入研究苦參堿對人髓母細胞瘤細胞增殖和凋亡的作用及其調(diào)節(jié)機制，通過干預(yù)腫瘤細胞凋亡活性，誘導腫瘤細胞的凋亡，在人髓母細胞瘤治療領(lǐng)域具有廣泛且深遠的臨床意義和應(yīng)用前景。

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